Cellakultúra, vírusamplifikáció és tisztítás a SHAPE-MaP és SPLASH kísérletekhez

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) és Madin-Darby canine kidney (MDCK) sejteket 2 mM l-glutaminnal és 10% FCS-vel kiegészített Minimum Essential Mediumban (Merck) neveltük. A WSN (H1N1) vírus állományokat MDBK sejtek influenzavírussal való fertőzésével állítottuk elő 0,01-es fertőzési multiplicitással (MOI). Az Udorn (H3N2) és PR8 (H1N1) (PR8) vírusállományokat MDCK sejtek 0,001-es MOI-nál történő fertőzésével állítottuk elő 0,8 μg ml-1 n-Tozil-l-fenilalanin-klórmetil-keton (TPCK) kezelt tripszin (Merck) jelenlétében. A vírusokat a fertőzés után 2 nappal gyűjtöttük be. A vírusokat ultracentrifugálással tisztítottuk: először a fertőzött sejttenyészet közegét 4 000 fordulatszámon 10 percig 4 °C-on végzett centrifugálással tisztítottuk, amelyet 10 000 fordulatszámon 15 percig 4 °C-on végzett centrifugálás követett. A vírust ezután 30 %-os szacharózpárnán keresztül, SW 32 rotoron (Beckman Coulter) 25 000 fordulatszámon, 4 °C-on 90 percig tartó centrifugálással tisztítottuk. A megtisztított vírus pelletet reszuszpendáltuk reszuszpendáló pufferben (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Megjegyezzük, hogy sem a virion, sem az RNS tercier szerkezetét nem bontja meg az ultracentrifugálás30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP-t a közzétett prokották17 szerint végeztük; az 1-metil-7-nitroizatósav-anhidridet (1M7) 4-nitroizatósav-anhidridből szintetizáltuk a korábban leírtak szerint33. Az in vitro átírt RNS-kísérletekhez minden egyes vírus-RNS-szegmenst lineáris DNS-sablonból szintetizáltunk a HiScribe T7 High Yield RNS Synthesis Kit (New England Biolabs) segítségével. A termékek méretét és tisztaságát 3,5%-os poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) gélen ellenőriztük. A csupasz vírus RNS-mintákat a WSN-részecskék szacharózpárnán történő tisztításával állítottuk elő a korábban leírtak szerint. A megtisztított vírusokat 250 μg ml-1 proteináz K-val (Roche) kezeltük proteináz K pufferben (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) 40 percig 37 °C-on. A módosítás előtt az in vitro átírt RNS és a csupasz vírus RNS mintákat 37 °C-on 30 percig hajtogattuk hajtogatási pufferben (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Az 1M7-et (vízmentes dimetilszulfoxidban (DMSO; Merck) oldva 10 mM végső koncentrációban adtuk a hajtogatott RNS-hez, és a mintákat 75 s-ig inkubáltuk 37 °C-on. Az in virio módosításokat úgy végeztük, hogy 1M7-et közvetlenül a tisztított vírushoz adtunk. A SHAPE-MaP reagensek vírusrészecskékbe való behatolási képességét kezdetben a korábban leírtak34 szerint vizsgáltuk, 32P-jelölt primer hosszabbítások elvégzésével a SHAPE-MaP reagenssel kezelt vírusból kivont RNS-en egy NA szegmenset célzó primer (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGAGACG-3′) használatával. Az 1M7-kezelt mintákkal párhuzamosan a kontrollmintákat DMSO-val kezeltük. n-metilizatósav-anhidrid (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP reagenssel is vizsgáltuk virio. Az NMIA-val végzett kísérleteket az 1M7 esetében leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a tisztított virionokat 45 percig kezeltük NMIA-val.

A szekvenáló könyvtárkészítést a korábban leírtak szerint17 végeztük a randomomer munkafolyamat szerint. Röviden, az 1M7 vagy kontroll kezelést követően az RNS-t az RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research) segítségével tisztítottuk. Az RNS-t a Random Primer Mix (New England Biolabs) és SuperScript II (Invitrogen) segítségével reverz transzkripcióztuk MaP pufferben (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiotreitol és 0,5 mM dezoxinukleozid-trifoszfát). A DNS-könyvtárak elkészítéséhez a Nextera XT DNS Library Prep Kit-et (Illumina) használtuk. A végleges PCR-amplifikációs termékeket Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) segítségével méretszelektáltuk, és az Agilent DNA 1000 kit (Agilent Technologies) segítségével a minőséget Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies) segítségével értékeltük. A WSN, a csupasz vírus-RNS és az in vitro átírt RNS esetében a könyvtárak szekvenálása (2 × 150 bázispár (bp)) HiSeq 4000 rendszeren (Illumina) történt; a PR8 és Udorn vírusok esetében a könyvtárak szekvenálása (1 × 150 bp) NextSeq 500 rendszeren (Illumina).

SPLASH

A WSN, PR8 és Udorn vírusok egyenként két replikátuma és a H3N2 reasszortáns vírusok egy-egy replikátuma esetében a korábban közzétett24,35 módon készültek, néhány módosítással. A tisztított vírust 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) és 0,01% digitonin (Merck) 200 μM-mal inkubáltuk 5 percig 37 °C-on. A vírust 6 lyukú tányérra terítettük, üveglemezzel lefedtük, jégre helyeztük és 45 percig UVP Ultra Violet Product kézi UV-lámpával (Thermo Fisher Scientific) besugároztuk. A térhálósított vírust proteináz K-val kezeltük, és a vírus RNS-t TRIzol (Invitrogen) segítségével extraháltuk. A kivont vírus-RNS egy aliquotját biotin beépülésének kimutatására használtuk egy kemilumineszcens nukleinsav detektáló modul készlet (Thermo Fisher Scientific) segítségével Hybond-N nejlonmembránon (GE Healthcare Life Sciences). Az extrahált vírus-RNS fennmaradó részét a NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) segítségével fragmentáltuk, és az RNA Clean & Concentrator-5 Kit segítségével méretszelektáltuk a 200 nt-nél rövidebb fragmentumokat. A mintákat Dynabeads MyOne Streptavidin C1 gyöngyökkel (Thermo Fisher Scientific) dúsítottuk biotinilált vírus-RNS-re; a gyöngyön történő proximity ligációt és a psoralen-keresztkötés visszafordítását a korábban közzétett módon végeztük24,35 . A szekvenáló könyvtárakat a kereskedelmi SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories) segítségével állítottuk elő. A végső méretszelekciót a PCR-amplifikált szekvenáló könyvtárak 6%-os PAGE gélen (Thermo Fisher Scientific), Tris/Bórsav/EDTA (TBE) oldatban történő futtatásával végeztük, 200-300 bp DNS-t szelektálva. A könyvtárakat 1 × 150 bp szekvenáltuk NextSeq 500 rendszeren.

A SHAPE-MaP szekvenáló olvasatok feldolgozása

A szekvenáló olvasatokat az adaptorok eltávolítása érdekében a Skewer v0.2.2 (hivatkozás 36) segítségével vágtuk le. A SHAPE-MaP reaktivitási profilokat a közzétett ShapeMapper2 pipeline37 segítségével hoztuk létre, amely a leolvasásokat a referencia genomhoz igazítja, és minden egyes nukleotidpozícióban kiszámítja a mutációs rátákat. A mutációs rátákat ezután a következőképpen meghatározott SHAPE-MaP reaktivitási értékekké alakítjuk át:

ahol mutr1M7 a nukleotidmutációs ráta az 1M7 kezelt mintában, mutrDMSO pedig a mutációs ráta a DMSO kezelt mintában. Minden SHAPE-MaP-reaktivitást egy közelítőleg 0-2 skálára normalizáltunk úgy, hogy a SHAPE-MaP-reaktivitási értékeket elosztottuk a 10% legjobban reaktív nukleotidok átlagos reaktivitásával, miután kizártuk a kiugró értékeket (amelyeket olyan nukleotidokként definiáltunk, amelyek reaktivitási értéke >1,5 az interkvartilis tartomány). A magas SHAPE-MaP-reaktivitások az RNS rugalmasabb (azaz egyszálú) régióit jelzik, az alacsony SHAPE-MaP-reaktivitások pedig az RNS szerkezetileg korlátozottabb (azaz bázispáros) régióit.

A SPLASH szekvenálási leolvasások feldolgozása

A szekvenálási leolvasásokat az adaptorok eltávolítása érdekében a Skewer v0.2.2 (hivatkozás 36) segítségével vágtuk le. A STAR v.2.5.3 (hivatkozás 38) segítségével a leolvasásokat a megfelelő vírusreferencia-genomhoz igazítottuk (2. kiegészítő táblázat). A további feldolgozás során csak azokat a kiméra leolvasásokat használtuk fel, ahol legalább 20 nt illeszkedett a referencia szegmensekhez (STAR paraméter: -chimSegmentMin 20). A kiméra leolvasásokat CIGAR-stringek és illesztési pozíciók segítségével deduplikáltuk. Az egyes olvasási igazítások CIGAR-stringjeit feldolgoztuk, hogy megtaláljuk az olvasás kezdő és végkoordinátáit. A kiméra olvasási koordinátákat a szekvencia kölcsönhatások mátrixának előállítására használtuk az R szoftverben. A mátrixban diszkrét lókuszokat választottunk ki és egyenként illesztettük egy Gauss-görbével az olvasási átfedés intenzitása alapján, hogy kölcsönhatási ablakot határozzunk meg; a komplex átfedésű lókuszok kölcsönhatási ablakait külön ablakokra osztottuk. A kölcsönhatási ablak szélességét használtuk az egyes kölcsönhatások kezdő- és végkoordinátáinak meghatározására; a kölcsönhatás gyakoriságának mérésére azon leolvasások számát használtuk, amelyek ezen a területen belül (vagy részben azon belül) voltak. Az ábrák előállításához az egyes vírusok 20 legjobb kölcsönhatását az R v.3.5.1-ben a circlize v.0.4.5 csomag (ref. 39) segítségével vizualizáltuk. A kölcsönhatási lókuszok teljes készletét a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza. A kölcsönhatási lókuszok qPCR validálásához psoralen-keresztkötésű mintákat készítettünk és dúsítottunk a korábban leírtak szerint, de a hosszabb RNS-fragmentumok létrehozása érdekében lerövidített fragmentálási idővel (3 vs. 4 perc). Az RNS-t poliadeniláltuk Poly(A) polimerázzal (Takara Bio), és komplementer DNS-t generáltunk az smRNA dT Primer (Takara Bio) és PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. 50 ciklusos qPCR-t végeztünk a gyártó utasításai szerint StepOnePlus műszeren (Applied Biosystems) a Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) és primerpárok felhasználásával a szakaszok közötti kölcsönhatások vizsgálatához. A primer szekvenciákat a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. A qPCR-amplifikáció 50 ciklusát követően a termékeket 8%-os PAGE (29:1 akrilamid/bis-akrilamid, 1× TBE puffer) segítségével oldottuk fel, és kék fényű átvilágítással vizualizáltuk.

RNS szerkezet előrejelzések

The IntaRNA algorithm v.2.3.1 (ref. 40) algoritmust használtuk az RNS-RNS kölcsönhatások képességének előrejelzésére a SPLASH elemzés során azonosított régiókban, az Exact mód (-mode E) és a no seed constraint (-noSeed) opciók használatával. Az RNS-RNS kölcsönhatások modellezésébe bevontuk a SHAPE-MaP reaktivitásokat (-tShape és -qShape). Permutált adathalmazokat hoztunk létre a SPLASH által azonosított specifikus kölcsönhatási partnerek véletlenszerű keverésével és a kölcsönhatási ΔG energiák értékelésével az IntaRNA segítségével. Az SPLASH által azonosított intermolekuláris RNS kölcsönhatásokhoz kapcsolódó ΔG energiák valószínűségi eloszlásai és a permutált adatkészletek közötti különbség szignifikanciáját az R szoftverben a Wilcoxon rank-sum teszt segítségével számoltuk ki. Az IntaRNS-struktúra-előrejelzéseket ezután arra használtuk, hogy a kölcsönhatási régiókat a bázispárosodásban részt vevő nukleotidokra trimmeljük. Ahol nem álltak rendelkezésre SHAPE-MaP adatok (PR8 reasszortánsok H3N2 vírusokkal), ott az egyes RNS-szálak előhajtását (“hozzáférhetőség”) kikapcsoltuk az IntaRNA-ban (-qAcc = N -tAcc = N). Az ismert szerkezetekkel való validáláshoz az RNS másodlagos szerkezetére vonatkozó adatokat az RNA3Dhub adatbázisból41 nyertük, a 80S riboszóma42 (PDB: 6EK0) és az U4/U6.U5 hármas kis nukleáris ribonukleoprotein spliceoszomális komplex43 (EMDB: EMD-2966) kriogén elektronmikroszkópos szerkezete alapján. A referencia RNS-szekvenciákat a riboszomális RNS és az U4/U6 kis nukleáris RNS szekvenciáinak szarvasmarha (MDBK) szekvenciáinak megfeleltetésére korrigáltuk a korábban leírtak szerint44. Az intramolekuláris RNS-szerkezet előrejelzéséhez a ViennaRNA v.2.0 csomagot (hivatkozás 45) használtuk. Az RNAfold parancsot használtuk az egyes szegmensek másodlagos RNS-struktúráinak és felosztási funkcióinak előrejelzésére. A SHAPE-MaP reaktivitásokat pszeudoenergiás korlátozóként vettük figyelembe. Az ex virio és in virio SHAPE-MaP reaktivitási profilok közötti 50 nt-os csúszó medián ablakos korrelációs analízist használtunk a T7-transzkripciós és vRNP-asszociált RNS közötti SHAPE-MaP korreláció mértékének meghatározására. Azt találtuk, hogy nincs korreláció >150 nt; ezért a szerkezet- és partíciófunkció-előrejelzésekhez a maximális párosítási távolságot 150 nt-ra korlátoztuk. Az intramolekuláris szerkezet-előrejelzésekhez a promóter-régióban lévő nukleotidokat egyszálúnak állítottuk be.

Az influenzavírusok fordított szerkesztéséhez használt sejtkultúra

MDCK sejteket és humán embrionális vesesejteket (HEK 293T) a Melbourne-i Egyetem Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszékének meglévő gyűjteményéből szereztük be. Az MDCK sejteket Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-es tápfolyadékban (Sigma-Aldrich), a HEK 293T sejteket pedig DMEM-ben (Thermo Fisher Scientific) tenyésztették. Mindkét táptalajt 10% hő inaktivált FCS-vel, 2 mM l-glutaminnal, 2 mM nátrium-piruváttal, 24 μg ml-1 gentamicinnel, 50 μg ml-1 streptomicinnel és 50 IU ml-1 penicillinnel egészítettük ki. A transzfekcióhoz az MDCK sejtek és a HEK 293T sejtek kokultúráit Opti-MEM-ben (Thermo Fisher Scientific) hoztuk létre 50 μg ml-1 streptomicinnel és 50 IU ml-1 penicillinnel.

Reverse módosított influenzavírusok szerkesztése

A PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) és Wyo03 (H3N2) vírusok egyes génszegmenseit reverz transzkriptáltuk és pHW2000 plazmidokba46 klónoztuk. A reverz genetikával előállított vírusok vagy PR8, Udorn, Mem71, PC73 vagy Wyo03 PB1 gént tartalmaztak vad típusú vagy módosított NA génnel a PR8 vírus hat szegmensét (PB2, PA, HA, NP, M és NS) tartalmazó genetikai háttérben. A módosított NA-gén (Wyo03UdSub) a Wyo03-ból származott, és az Udorn-NA szekvenciához képest 4 szubsztitúciót tartalmazott: G943A; C938U; U933C; és G923A nukleotidok. E négy nukleotidból három csendes volt, a negyedik (A534G) konzervatív lizin-arginin változást eredményezett (K172R). Az ezeket a változásokat tartalmazó komplementer fragmentumokat PCR segítségével állítottuk elő, és egy másik PCR-fordulóval, BsmBI restrikciós helyeket tartalmazó szegmensspecifikus primerek47 használatával egyesítettük; a terméket a pHW2000 expressziós vektorba klónoztuk a vírusmentéshez. A primer szekvenciákat a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. A megmentett vírusokat 10-d embriózott tyúktojásokban amplifikáltuk. A fertőző allantoikus folyadék vírustartalmát MDCK sejtekben történő plakkképzéssel48 titráltuk, és -80 °C-on tároltuk.

A fordítottan előállított vírusok vírusreplikációs kinetikájának meghatározása

A fordítottan előállított vírusok replikációs jellemzőit MDCK sejtek 0,01-es MOI-n történő fertőzésével határoztuk meg. Az 1 órás felszívódást követően (t = 0 órakor) az inokulumot eltávolítottuk, a sejteket mostuk és 37 °C-on, 5% CO2-on inkubáltuk 2 mM l-glutaminnal, 2 mM nátrium-piruváttal, 24 μg ml-1 gentamicinnel, 50 μg ml-1 streptomicinnel, 50 IU ml-1 penicillinnel és 1 μg ml-1 TPCK-val kezelt tripszinnel (Worthington Biochemical Corporation) kiegészített RPMI 1640-ben. A sejtkultúra felülúszókat a fertőzés utáni különböző időpontokban gyűjtöttük, és -80 °C-on tároltuk az elemzéshez. A vírustitereket MDCK sejtek konfluens monolayerén történő plakkképzéssel határoztuk meg.

Az influenzavírusok kilenc plazmidos kompetitív reverzális génszerkesztése

Az influenzavírusok kompetitív reverzális génszerkesztését a nyolc plazmidos reverzális genetikai rendszer26 módosított változatával végeztük a korábban leírtak szerint25. Röviden, a PR8 PB2, PB1, PA, hemagglutinin (HA), nukleoproteint (NP), mátrixfehérjét (M) és nem strukturális fehérjét (NS) kódoló plazmidokat a neuraminidáz (NA) vírus RNS-t és az Udorn, Mem71, PC73 vagy a vad típusú vagy módosított Wyo03 versengő PB1 vírus RNS-ét kódoló plazmidokkal kotranszfektálták. Mindegyik plazmidot (1 µg) összekevertük FuGENE 6 transzfekciós reagenssel (Promega) Opti-MEM-ben, és HEK 293T és MDCK sejtek kokultúrájához adtuk. Hat órával a transzfekció után a médiumot 50 μg ml-1 streptomicinnel és 50 IU ml-1 penicillinnel kiegészített Opti-MEM-re cseréltük. Huszonnégy órával később TPCK-val kezelt tripszint (1 μg ml-1) adtunk hozzá, majd a felülúszót további 42 óra elteltével összegyűjtöttük és -80 °C-on tároltuk. A konkurens PB1 gének beépülési gyakoriságának meghatározásához a transzfekciós felülúszóban lévő utódvírusokat MDCK sejtekben plakkvizsgálatnak vetettük alá. Véletlenszerűen kiválasztott plakkokat (kísérletenként kb. 36 db) szedtünk ki az agarózon keresztül mintavételezéssel, és 0,05%-os Triton-X100-ban reszuszpendáltuk. A versengő génszakaszok forrását génspecifikus kvantitatív RT-PCR segítségével azonosítottuk a SensiFast probe no-ROX egylépéses RT-PCR Kit (Bioline) segítségével. Minden 20 μl-es reakciót 5 μl plakkolt vírusszuszpenzió, 10 μl 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0,2 μl reverz transzkriptáz, 0,4 μl Ribosafe RNase inhibitor, 0,8 μl egyenként 10 μM génspecifikus forward és reverse primer és 0,08 μl egyenként 25 μM génspecifikus szonda felhasználásával végeztünk. A primerek és a szondák szekvenciáit a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. Az RT-PCR reakciót 10 percig inkubáltuk 45 °C-on, mielőtt folytattuk a qPCR-amplifikációt a gyártó utasításainak megfelelően. A közölt értékek 3-8 független transzfekciós kísérlet kombinált adatai minden egyes verseny esetében.

Beszámolói összefoglaló

A kutatás tervezésével kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.