Eredmények és vita
A Pt oxidáció két útja E. coli-ban. Genetikai vizsgálatok kimutatták, hogy a phn operon által kódolt C-P liáz enzim képes a Pt oxidációjára (26). Egy nemrégiben végzett vizsgálatban (9) azonban meglepődve tapasztaltuk, hogy néhány E. coli phn mutáns továbbra is képes a Pt oxidációjára. E törzsek genotípusának vizsgálata arra utalt, hogy a phoA lokusz is részt vehet a Pt oxidációjában. E hipotézis közvetlen tesztelése érdekében olyan E. coli törzseket vizsgáltunk, amelyek kizárólag a phn és a phoA lokuszban különböztek a Pt oxidálására való képességük szempontjából, amit a Pt-t egyedüli P-forrásként tartalmazó táptalajon való növekedési képességük mutatott ki. Mivel a növekedéshez foszfátra van szükség, az organizmusok csak akkor tudnak ezen a táptalajon növekedni, ha képesek a Pt-t foszfáttá oxidálni. A phoA + vagy phn + törzsek Pt táptalajon nőttek (függetlenül attól, hogy a másik lókusz mutálódott-e), míg a phn és phoA mutációval rendelkező törzsek nem (1. ábra). Az E. coli-nak tehát két útvonala van a Pt oxidációjára: egy phn-függő és egy phoA-függő.
E hipotézis alátámasztására mind in vitro, mind in vivo kimutattuk a Pt-függő H2-termelődést. Az in vitro vizsgálatokat aerob módon, lezárt fiolákban végeztük, nagy tisztaságú BAP felhasználásával. Az inkubáció után a fejteret H2-re, a vizes részt pedig foszfátra vizsgáltuk. Amint a 2B. ábrán látható, sztöchiometrikus mennyiségű foszfát és H2 keletkezett a Pt-ből BAP jelenlétében, míg a BAP-ot vagy csak Pt-t tartalmazó kontrollreakciókban sem foszfát, sem H2 nem keletkezett.
A BAP-katalizált Pt-oxidáció termékei a foszfát és a molekuláris H2. (A) A proton-dekupált 31P magmágneses rezonancia spektrumok és a csúcsok helyzete 5 mM Pt és 5 mM foszfát kontrollok, valamint egy éjszakai reakció esetében, amely kezdetben 5 mM Pt-t és 500 μg tisztított BAP-ot tartalmazott. Az enzimatikus reakció spektrumában egy nem reagált Pt-csúcs és egy új foszfátcsúcs látható, de más termék nem keletkezett. A foszfátcsúcs helyzetének enyhe eltolódása a kontroll és a BAP-katalizált reakciótermék között kisebb pH-különbségekre vezethető vissza: a foszfát törzsoldat hozzáadása a vizsgálathoz megnövelte a Pi csúcs magasságát, de nem hozott létre további csúcsokat. A proton-kapcsolt spektrumok teljesen összhangban vannak ezzel az értelmezéssel (az adatok nem láthatóak). (B) A BAP-katalizált Pt-oxidáció sztöchiometrikus mennyiségű foszfátot és molekuláris H2-t termel. A jelzett komponenseket tartalmazó in vitro reakciókat egy éjszakán át 37°C-on inkubáltuk lezárt üvegekben. Ezután a headspace atmoszférából H2-t vizsgáltunk gázkromatográfiával, hővezető detektálással, míg a vizes fázisból foszfátot vizsgáltunk malachit-zöld próbával. A reakciókat (3 ml) 50 mM Mopsban (pH 7,0) 50 mM Pt-vel (pH 7,0) és 387 μg tisztított BAP-pal végeztük a jelzett módon. Háromszoros kontrollokat végeztünk, amelyek csak BAP-ot vagy csak Pt-t tartalmaztak, de sem foszfátot, sem H2-t nem mutattunk ki ilyen körülmények között. Az in vivo eredmények a WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) 2,5 μmol a jelzett P-forrásból 2,5 μmol-t tartalmazó 0,4%-os glükóz/Mops-lében történő növekedés során termelt H2 mennyiségét mutatják. Mivel ez a P-szint (500 μM) növekedéskorlátozó, a P-forrás várhatóan teljesen asszimilálódik, amikor a kultúrák elérik a telítettséget. A lezárt üvegekben 37°C-on történő egy éjszakán át tartó növekedést követően a fejtérben H2-t vizsgáltunk gázkromatográfiával, hővezető detektálással. Mind az in vitro, mind az in vivo kísérleteket aerob módon végeztük (azaz a Pt oxidációja során O2 volt jelen).
A H2 in vivo mérését megnehezíti, hogy az E. coli több hidrogenázzal rendelkezik, amelyek képesek H2-t termelni és fogyasztani is. E probléma megkerülésére egy ΔhypABCDE mutánst konstruáltunk, amely nem képes aktív hidrogenázokat termelni, mivel képtelen a prekurzor fehérjék érlelésére (32). A zárt csövekben aerob módon tenyésztett hyp mutáns nagyjából sztöchiometrikus mennyiségű H2-t termelt a növekedést korlátozó Pt-szintekkel tenyésztett kultúrákban is, míg a foszfát vagy a foszfátészter foszfoszferin limitáló szintjével tenyésztett kultúrákban nem mutattunk ki H2-t (2B ábra ).
A Pt-oxidáció nem közös jellemzője minden alkáli foszfatáznak. Úgy tűnik, hogy a hatékony Pt-oxidáció az E. coli alkalikus foszfatázok egyedi jellemzője. Sem a Bacillus subtilis, amelyről ismert, hogy több nagy aktivitású foszfatázt termel (33), sem a P. stutzeri, amelyről ismert, hogy a BAP-tól eltérő foszfatázt termel (olyan törzsekben, amelyekből hiányzik a Pt-dehidrogenáz rendszer) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson és W. W. M., publikálatlan adatok), nem képes Pt-t kizárólagos P-forrásként használni (3A ábra), bár mindkét organizmus olyan táptalajon növekszik, ahol a foszforszerin az egyetlen P-forrás (adat nem látható). Így az ezen organizmusok által termelt foszfatázok nem képesek a Pt olyan mértékű oxidációjára, amely elegendő a növekedés fenntartásához. A borjúbél foszfatáz (CIP) és a garnélarák lúgos foszfatáz (SAP) kereskedelmi készítményeit is megvizsgáltuk, hogy képesek-e Pt-ból foszfátot előállítani (3B. ábra). Bár az eukarióta foszfatázok egy éjszakai inkubáció után kis mennyiségű foszfátot állítottak elő, csak az E. coli BAP volt képes jelentős sebességgel katalizálni a reakciót. Ez a megállapítás azért különösen meglepő, mert az eukarióta enzimek valójában sokkal jobb foszfatázok, a BAP-nál akár 40-szer nagyobb specifikus aktivitással (27). Ezek az enzimek mind jelentős homológiát mutatnak (25-35%-os azonosság) az E. coli BAP-pal; ráadásul a legtöbb aktív centrum-maradék, beleértve a Ser-102-t (amely a foszfatáz reakció során kovalens foszfo-enzim intermediert képez), konzervált (27).
A Pt oxidáció csak az E. coli alkalikus foszfatázra jellemző. (A) A B. subtilis és a P. stutzeri Pt oxidációs képességét vizsgáltuk, amit a Pt-t egyedüli P-forrásként tartalmazó táptalajon való növekedéssel mutattunk ki, az 1. ábrán leírtak szerint. Egyik organizmus sem nőtt a Pt táptalajon, míg mindkét organizmus foszfátos táptalajon nőtt. Így annak ellenére, hogy mindkét organizmus aktív foszfatázokkal rendelkezik, egyikük sem képes a Pt oxidációjára a növekedés fenntartásához elegendő mértékben. A P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) olyan mutációkat tartalmaz, amelyek megszüntetik a szervezet két jellemzett Pt-oxidációs útvonalát, de nem befolyásolják a foszfatáz expresszióját (9, 10). (B) A BAP (E. coli alkalikus foszfatáz), SAP (garnélarák alkalikus foszfatáz; Roche Applied Science, Mannheim, Németország) és CIP (borjúbél foszfatáz; Sigma) Pt oxidációját a fent leírtak szerint vizsgáltuk. Minden egyes vizsgálatban 56 μg jelzett foszfatázt használtunk, ami 3 BAP, 32 SAP és 65 CIP foszfatáz egységnek felel meg, a pNPP hidrolízisével mérve. Az eukarióta enzimek jóval nagyobb foszfatáz aktivitása ellenére csak a BAP katalizálta a Pt oxidációt jelentős sebességgel. Két kísérlet átlagát ábrázoltuk.
Az tűnik hihetőnek, hogy a Pt oxidációt a BAP a foszfátészter-hidrolízishez hasonló mechanizmussal katalizálja (4A ábra ). Ennek megfelelően a Pt-t a BAP hidrolizálhatja hidrid-anionnal, mint formális távozó csoporttal. Ezt az elképzelést alátámasztja, hogy egy olyan phoA mutáns, amelyben az aktív központ Ser-102 maradékát alaninra cserélték, nem képes a Pt-t egyedüli P-forrásként használni, ami azt jelzi, hogy ez az aminosav szükséges a foszfátészter-hidrolízishez (27) és a Pt oxidációjához (4B. ábra ). Bár a szubsztrátról a vizes protonra történő közvetlen hidridátvitel biokémiai szempontból példa nélküli, ez a reakció termodinamikailag ésszerű, tekintettel a foszfát-Pt pár erős redukáló potenciáljára (E o′ = -0,650 V). Így a H-termelő reakció meglehetősen kedvező: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (a redoxpotenciálokból kiszámítva a 34. hivatkozásban). Ha a Pt oxidáció hidrolitikus modellje helyesnek bizonyul, akkor ez egy nagyon szokatlan enzimatikus reakció lenne. Vizsgálatok kimutatták, hogy a BAP képes a foszfodiészterek (35), foszfoamidok (36), szulfátészterek (37) és tiofoszfát (38) hidrolízisére is. Ezek a reakciók azonban a Pt-hidrolízisreakciónál lényegesen lassabb sebességgel játszódnak le, annak ellenére, hogy sokkal jobb távozócsoportok vesznek részt bennük. Emellett ezek nem redoxireakciók. Az alkilfoszfonsavak hidrolízisével járó analóg reakciót a BAP nem katalizálja, amint azt biokémiai úton (39) és a Δphn törzsek azon képtelensége is mutatja, hogy ezeket a vegyületeket egyedüli P-forrásként használják (13).
A Pt oxidációja BAP által hidrolízis útján történhet, hidrid-anionnal mint távozó csoporttal. (A) A foszfátészter BAP általi hidrolízisének kémiai mechanizmusa magában foglalja egy aktivált szerinmaradék (Ser-102) nukleofil támadását a foszfátészteren egy foszfoszferin enzimintermedier képződéséhez. Az alkoxid kilépő csoport gyorsan felvesz egy protont az oldatból, hogy a megfelelő alkoholt képezze. Valószínűnek tűnik, hogy a Pt-oxidáció hasonló mechanizmussal történik, hidrid-anionnal mint kilépő csoporttal. (B) A Ser-102 szerepét a Pt oxidációjában úgy vizsgáltuk, hogy megvizsgáltuk, hogy a phoA génben Ser-102-Ala mutációt hordozó mutáns képes-e Pt táptalajon növekedni az 1. ábrán leírtak szerint. A mutáns nem tudott Pt táptalajon növekedni, ami bizonyítja, hogy a Pt-oxidációban az aktív helyen lévő Ser-102 szükséges. A gazdatörzs a BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30) volt, a WM3610 és WM3611 a pKY1 és pKY2 plazmidok egy-egy példányos integránsát hordozza, amelyek a vad típusú phoA gént (phoA+), illetve a phoA-S102A mutánst (Ser-102-Ala) kódolják.
A Pt-dehidrogenáz (PtxD) volt az egyetlen in vitro jellemzett enzim, amelyről kimutatták, hogy katalizálja a Pt oxidációját (11). Bár a BAP-reakció részletei még tisztázásra várnak, a két enzim kémiai mechanizmusa egyértelműen különbözik egymástól. Míg a PtxD-nek NAD-ra van szüksége elektronakceptorként a redoxireakcióhoz, addig a BAP által katalizált reakció nem igényel exogén elektronakceptort, hanem a reakció nagy termodinamikai hajtóerejét kihasználva vízből egy erősen redukált terméket (H2) állít elő egy lényegében irreverzibilis reakcióban (számított K eq = 1,1 × 108). Az összes többi ismert H2-termelő reakció sokkal közelebb működik a kémiai egyensúlyhoz, és jellemzően reverzibilis. Ráadásul az összes többi ismert hidrogenáz vagy Fe-t vagy Ni-t, vagy mindkettőt tartalmazza aktív centrumában (40). Ez a megfigyelés magában foglalja a metanogén archaea úgynevezett “fémmentes” H2-képző metilén-tetrahidrometanopterin-dehidrogenázát is, amelyről ma már tudjuk, hogy Fe-t is tartalmaz (41). Ezzel szemben a BAP nem tartalmaz redox-aktív fémeket, bár a hidrolitikus aktivitáshoz mind a Zn, mind a Mg szükséges (27). A BAP kelátorokkal való kezelése gátolja a Pt oxidációját, ami arra utal, hogy a fémek szerepet játszanak a Pt reakcióban (az adatok nem láthatóak).
Végezetül, az itt bemutatott in vivo adatok arra utalnak, hogy a Pt oxidációs reakció biológiailag releváns. Az a megfigyelés, hogy számos baktérium rendelkezik Pt-oxidációra dedikált enzimekkel, azt mutatja, hogy ez a tulajdonság erős szelekciós nyomás alatt áll a mikrobiális populációkban (4, 5, 9, 42). Ezt a tényt szem előtt tartva érdekes megjegyezni, hogy bár az eukarióta enzimek sokkal jobb foszfatázok, Pt-oxidációra nem képesek. Ez a megfigyelés felveti annak lehetőségét, hogy az E. coli BAP talán nem úgy fejlődött ki, hogy a leghatékonyabb foszfatáz legyen, hanem inkább olyan foszfatáz, amely képes a Pt hidrolizálására. Ez az elképzelés összhangban van azzal a különös megfigyeléssel, hogy az E. coli BAP foszfát-éheztetéses körülmények között igen nagymértékben expresszálódik (a teljes sejtfehérje akár 6%-a) (28). A hagyományos magyarázat erre a jelenségre az, hogy valamilyen ismeretlen BAP szubsztrátnak rosszul hidrolizálhatónak kell lennie, és ezért nagy mennyiségű enzimet igényel a kompetitív növekedési sebesség fenntartásához. Mivel azonban a foszfátészter-szubsztrátok széles skálájára mért hidrolízisráták között alig van különbség (39, 43), valószínűtlennek tűnik, hogy ez a gyenge szubsztrát foszfátészter lehet. Ezzel szemben a Pt hidrolízis sebessége lényegesen alacsonyabb, mint a foszfátészter hidrolízis sebessége, ami arra utal, hogy a Pt lehet az a szubsztrát, amely a foszfát-éheztetett E. coli-ban megfigyelt extrém mértékű phoA expresszióért felelős.
A Pt-val történő BAP reakció számos részletét még nyilvánvalóan tisztázni kell. Ennek az egyedülálló reakciónak a további tanulmányozása valószínűleg nemcsak a P redox kémiájának és a foszforil-transzfer reakcióknak a megértéséhez járul hozzá, hanem a hidridtranszferről, a H2 termelő reakciókról és a redukált P vegyületek természetben betöltött szerepéről szóló ismereteinkhez is.