2.19.2.3.3 Az elúció körülményei
A hatékony elúciós oldatoknak ideális esetben meg kell bontaniuk az analit-antitest kölcsönhatásokat anélkül, hogy hátrányosan befolyásolnák az immobilizált Abs-t. A kiszorítószer olyan nagy koncentrációjú keresztreagáló molekula, amely képes biospecifikus deszorpciót előidézni. A kiszorító molekulák versenyeznek a kötött analit molekulákkal, és a nagy diszplacerfelesleg biztosítja az analit mennyiségi deszorpcióját. Az optimális teljesítmény érdekében a kiszorítónak több kritériumnak is meg kell felelnie: (1) nagy keresztreaktivitás az immobilizált antitestekkel, (2) az analitokétól jelentősen eltérő retenciós idő, mert a nagy felesleg kiemelkedő csúcsot okoz, amely könnyen zavarhatja az analitok kimutatását, (3) jó stabilitás és nagy tisztaság, mert a már 0,01-0,1%-os szinten jelen lévő szennyeződések megzavarhatják a kromatogramot, és (4) alacsony ár, nem toxikus tulajdonságok, hiánya valós mintákban és alacsony kimutathatóság az analitokhoz képest. Ezenkívül nagy mennyiségű elúciós oldatra van szükség, ami a klasszikus SPE hordozón az analízis előtt rekoncentrációt tesz szükségessé. Következésképpen előnyben részesítik azokat az elúciós feltételeket, amelyek lehetővé teszik a célanalit teljes visszanyerését kis elúciós térfogat mellett.
A kaotróp ionokat általában nagy molekulák, például fehérjék elúciójára használják. Ezek az ionok megbontják a nagy molekulák, azaz az antitestek és a célmolekulák körüli vízszerkezetet, ami a hidrofób kölcsönhatások felszakadását idézi elő a nagy molekulaszerkezetekben, valamint az analit és az antitest között. A leggyakoribb kaotróp ionok a klorid-, jodid-, perklorát- és tiocianát-ionok, 1,5 és 8 mol l-1 közötti koncentrációban. A fehérjék IS-ből történő deszorpciójára sikeresen alkalmazható különböző vizes oldatokról azonban kiderült, hogy nem képesek kis molekulák deszorpciójára. A fehérje deszorpciója valószínűleg elsősorban a kötött fehérje szerkezetének változásán (részleges denaturáció), és nem az immobilizált antitestek szerkezetének változásán alapul. Ezért a denaturációra nem érzékeny kis molekulák elúciójához sokkal szigorúbb körülményekre van szükség. Ráadásul a hőmérséklet 4 °C-ról 43 °C-ra történő emelésével az antitest-analit kölcsönhatások disszociációs állandója két nagyságrenddel megnőhet. Ez a módszer nem elég hatékony ahhoz, hogy kis molekulák eluálására alkalmazzák. A kis molekulák IS-ből történő deszorbálására gyakran végeznek alacsony pH-jú oldatokkal történő eluálást, de ehhez három pH-egységre van szükség az antitest izoelektromos pontjától. Ez a fajta elúció (a pH eltolása az ionerősség megváltoztatása nélkül) elkerüli a labilis antitestek károsodását. Egyik kellemetlenség, hogy a teljes deszorpcióhoz még mindig nagy térfogatokra van szükség, ami csökkenti az extrakciós eljárásokhoz kapcsolódó dúsítási tényezőket.
A kis molekulák IS-ből történő hatékony elúciója víz-szerves módosító keverék csökkentett térfogatával érhető el. A 6. ábra példaként két herbicid, az izoproturon és az atrazin elúciós profilját mutatja be, miután az egyes analitekkel spiccelt vízmintát a megfelelő IS-en perkolálták. Több, vízzel kevert elúciós oldószert (metanol, etanol és ACN) vizsgáltunk.
6. ábra. Az atrazin, izoproturon, 2,4,6-triklórfenol és pentaklórfenol elúciós profiljai a megfelelő IS-ekből, növekvő mennyiségű szerves oldószert tartalmazó elúciós oldatokkal savasított vagy nem savasított vízben, az egyes analitekkel spiccelt vízminták perkolációját követően. ACN, acetonitril; MeOH, metanol; EtOH, etanol; AA, ecetsav; TFA, trifluorecetsav.
A kapott elúciós profilok erősen függnek az oldószer jellegétől. A három vizsgált oldószer mindkét analit teljes elúcióját lehetővé teszi. Az ACN mutatja azonban a legnagyobb elúciós erősséget: ennek az oldószernek a legalacsonyabb tartalma mindkét analit teljes elúcióját biztosítja. Az izoproturon és az atrazin kinyeréséhez 40%-os és 60%-os ACN-tartalom elegendő, míg a metanol 60%-os és 80%-os tartalma szükséges. Ebben az esetben úgy tűnik, hogy az oldószer elúciós ereje az oldószer hidrofób jellegével függ össze, mivel az ACN (Hildebrand oldhatósági paraméter δ = 24,3 MPa1/2) kevésbé poláris, mint az etanol (δ = 26,0 MPa1/2) és a metanol (δ = 29,7 MPa1/2). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a herbicidek és a hozzájuk tartozó antitestek közötti kölcsönhatások elsősorban hidrofób természetűek. A nem poláris oldószerek jelenléte csökkenti az antitest-analit kölcsönhatás hidrofób kötési komponensét. Ugyanakkor befolyásolja a hidrofób kötések stabilitását is, fenntartva az antitest tercier szerkezetét, és az antigén felszabadulását eredményezi. Az atrazin vagy az izoproturon megfelelő IS-ekből történő elúciójára vonatkozó példák azt mutatják, hogy hatékony elúció érhető el, ha közvetlenül nagy mennyiségű, 70-80%-os metanol vagy ACN adunk az elúciós frakcióhoz. Ez a nagy mennyiségű szerves módosító lehetővé teszi az elúciós frakció térfogatának lehető legnagyobb mértékű csökkentését, ami lehetővé teszi az analit koncentrálását az eluátumban. Ügyelni kell arra, hogy a kötési mód kiválasztása kompatibilis legyen ezekkel az eluálási feltételekkel. A nem kovalens kötés alkalmazása megakadályozza, hogy ilyen nagy mennyiségű módosítószert alkalmazzunk anélkül, hogy fennállna annak a veszélye, hogy az antitestek kötése megszakadna a szorbensből. A szol-gél eljárás alkalmazása az antitestek immobilizálására szintén korlátozza a nagy mennyiségű szerves oldószer használatának lehetőségét. Kimutatták, hogy a nagy mennyiségű szerves módosító, mint például az antitestek, az antitestek kimosódását okozza a szol-gél mátrixból.8
A szerves oldószer és szerves sav kombinációja néha szükséges. A 6. ábra szintén a 2,4,6-triklorofenol és a pentaklórfenol elúciós profilját mutatja be egy anti-pentaklórfenol IS-ből, hidro-szerves keveréket használva, sav hozzáadásával az eluáló oldathoz és anélkül. A triklórfenolt teljes mértékben vissza lehetett nyerni víz/ACN (20:80, v/v) vagy víz/ACN (30:70, v/v) trifluorecetsavval (TFA) 3 pH-értékre savanyított oldattal. Amikor a savasítást 1%-os (v/v) ecetsavval (AA) végeztük, az elúcióhoz csak 30% ACN-t tartalmazó keverék volt hatékony. Ezzel szemben a pentaklórfenol elúciója, amely nagyobb affinitással rendelkezik a PAbs-hoz, mint a triklórfenol, lehetetlen volt tiszta ACN-nel vagy TFA-val savasított ACN-nel. A deszorpciót csak 1% AA-t (v/v) tartalmazó 20:80 (v/v) arányú víz/ACN-nel lehetett elérni.
Ezért a legtöbb off-line eljárásban, beleértve az egyszer használatos kereskedelmi IS-ek felhasználásával ajánlott eljárásokat is, a deszorpciót nagy arányú szerves oldószerrel, néha alacsony pH-n érik el.
Összefoglalva, az elúciós körülmények megválasztása először az antitestek és az analitok közötti affinitástól függ. Függ továbbá az analit természetétől is, mivel az antigén-antitest kölcsönhatásokban részt vevő elektronikus és hidrofób kölcsönhatások aránya miatt. Végül pedig az antitestek immobilizálásának stratégiájától függ; a nem kovalens kötés megakadályozza a nagy mennyiségű szerves oldószer használatát.