A T-szabályozó sejtek (Tregek), korábbi nevükön T-szuppresszor sejtek, egy olyan T-sejt alcsoport, amely közvetlen szerepet játszik mind az autoimmunitásban, mind a kórokozókra adott válaszokban.

A Tregek az immunszuppresszív citokinek (IL-10, TGF-b) szekrécióján keresztül, valamint a gyulladásos effektor T-sejtek (például Th1 és Th17 sejtek) közvetlen elnyomása révén csökkentik a gyulladást.

A Tregek a saját antigénekkel szembeni tolerancia fenntartásához való hozzájárulással kontrollálják és valószínűleg megelőzik az autoimmun betegségeket. A Treg-transzfer terápiás előnye jól megalapozott állatmodellekben, és folyamatban vannak a humán Treg-terápiák megkezdésére irányuló erőfeszítések transzplantációs és 1-es típusú cukorbetegek számára.

Az egyedülálló T-sejt-alcsoport jelentőségét tekintve oly sok immunválaszban, sok kutató mulasztásnak érzi, ha immunfenotipizálja az őt érdeklő sejtpopulációkat anélkül, hogy a Treg-mérést is bevonná a keverékbe. A Tregek számszerűsítése azonban bonyolult lehet.

Milyen markereket érdemes használni például? Honnan tudhatjuk biztosan, hogy valódi szuppresszor T-sejteket mérünk?

Gating stratégiák a Tregek áramlási citometriás meghatározásához

A standard Treg gating stratégia mind egér, mind humán minták esetében (miután először gatingoltuk ki a doubleteket és gatingoltuk az élő sejteket) a CD3, CD4, CD25, FOXP3 és CD127 antigéneket tartalmazza.

Kizárólag az antigén-expressziót vizsgálva a Tregeket gyakran CD3+, CD4+, CD25hi, FOXP3+ és CD127lo-ként definiálják (az alábbi ábrán 1. lehetőségként látható). Ezeket a markereket használva gyakran egyértelmű populáció látható olyan mintákból, mint az egér lépsejtek és a humán PBMC.

Az aktivált T-sejtek azonban gyakran felfelé szabályozzák a CD25-öt, és a FOXP3 expresszióját találták az “effektor” (nem szuppresszív) T-sejtvonalakon. Ezért, ha kizárólag az áramlási citometriás fenotipizálásra támaszkodunk a Tregek meghatározásában, a gyulladásos T-sejtek báránybőrbe bújtatott farkasok (Tregek) lehetnek, és az adatok helytelen értelmezéséhez vezethetnek.

A sejt úgy nézhet ki, mint egy kacsa, de vajon kacsázik-e? A lehetséges Treg-populáció effektorfunkcióinak mérése nagyban segít megvilágítani az áramlási gátlási stratégia pontosságát. Annak megállapítására, hogy az Ön által Tregként definiált sejtek funkcionálisan hasonlítanak-e rájuk, a 2. lehetőség (lásd alább) magában foglalja a FOXP3 kihagyását a panelből, a CD3+, CD4+, CD25hi, CD127lo sejtek kiválogatását, majd a “Treg” populáció funkcióinak meghatározását citokin analízis és/vagy nem Treg T-sejtekkel (CD3+ CD4+ CD25-, CD127hi) végzett szuppressziós ko-kultúrás próbák segítségével. Jellemzően a FOXP3 nem szerepelhet olyan panelekben, ahol életképes sejtekre van szükség a válogatás után, mivel intracelluláris festésre van szükség.

A Treg szubszettek növekvő változatosságának meghatározása

A Tregeknek sokféle változata létezik, beleértve a tTregeket, pTregeket és iTregeket.

A tTregek (más néven nTregek) például a tímuszban keletkeznek, és olyan TcR-repertoárral rendelkeznek, amely elfogult a sajátpeptidek felé. Egy másik íz, az úgynevezett pTregek a periférián keletkeznek, az iTregeket pedig TGF-b segítségével indukálják kultúrában.

Ezekkel a különböző Treg-alcsoportokkal kapcsolatban vannak döntéshozók, és figyelembe kell venni őket egy Treg-ellenes testpanelben, ha a szubsztitúció érdekli őket. Emberekben például a CD39 megbízható tTreg markernek tekinthető. Továbbá, mind egerekben, mind emberekben a Helios megbízhatóan megkülönbözteti a tTregeket a p, és iTreg alcsoportoktól.

Egyetlen sejt Tregként való definiálása – lehetséges ez?

A Treg terület egyik fő korlátja az egyetlen sejt szuppressziós vizsgálatának hiánya.

Az egyes T-sejtek egy különálló memóriavonal – például Th1, Th2 vagy Th17 – tagjaként való meghatározása egysejtes felbontású analitikai elemzéssel, például intracelluláris citokinfestéssel érhető el, mivel ezeket a sejteket elsősorban, ha nem kizárólagosan az határozza meg, hogy milyen citokineket termelnek.

Az egyetlen sejt Treg-nek való bizonyításához azonban ideális esetben számszerűsíteni szeretnénk, hogy ez az egy kiválasztott sejt képes-e elnyomni az effektor T-sejtek (vagy más sejtalcsoportok) működését a ko-kultúrában. Jelenleg a Tregek szuppresszív funkcióját csak tömegkultúrában lehet tesztelni, ahol arra lehet következtetni, hogy a Tregként megjelölt sejtek egy része (de nem mind, esetleg még csak nem is a legtöbb) szuppresszív.

Még egyszer a lehetséges “effektor T-sejtek” báránybőrbe bújt farkasaira gondolva, egyszerűen nem tudjuk, hány nem szuppresszív, akár gyulladásos sejt rejtőzik a Treg-gátló stratégiánkban. Az áramlási citometria alkalmazása először az életképes, Treg-nek megfelelő markerekkel rendelkező sejtek bekapcsolására és szortírozására, majd funkcionális tesztelése annak megállapítására, hogy a bekapcsolási stratégia által meghatározott sejtek csoportként valóban Tregként viselkednek-e, jelenleg a legjobb módszer a Tregek számszerűsítésére a mintában.

A Tregek áramlási citometriás meghatározására szolgáló megfelelő bekapcsolási stratégiák alkalmazásával és a Treg-alcsoportok növekvő számának figyelembevételével kiválaszthatja az Ön számára érdekes Treg-populációkat. A kulcs az, hogy ezeket a populációkat azonosításuk után funkcionálisan teszteljük, mivel jelenleg nehéz, ha nem lehetetlen egyetlen sejtet Tregként definiálni. Azonban naponta történnek előrelépések, és végül az egyes Treg-sejtek helyes megjelölése is lehetséges lesz.

Ha többet szeretne megtudni a T-sejtek és más sejttípusok áramlási citometriás elemzéséről, és hozzáférést szeretne kapni az összes haladó anyagunkhoz, beleértve 20 oktatóvideót, prezentációkat, munkafüzeteket és privát csoporttagságot, iratkozzon fel az áramlási citometria mesterkurzus várólistájára.

.