Inváziós vizsgálat

Az anyagok:

Falcon 24 lyukú szövettenyésztő lemez

Falcon sejttenyésztő betét:8μm pórusméret, 24 lyuk formátum

Cat# 3097

Matrigel (hígítvaDMEM/F12-ben)

5% glutaraldehid 1XPBS-ben

0.5% Toluidinkék 2% Na2CO3-ban

Boyden-kamra előkészítése:

1. Steril csipesszel vegye ki a sejtfalbetéteket a csomagolásukból, és helyezze őket egy 24 lyukú lemez mélyedéseibe.
2. Mossuk át a betéteket 2-szer 300μl DMEM/F12-vel

(Vigyázzunk, hogy ne szúrjuk meg a membránt)

1. Adjunk 20μl 1:6 arányban hígított Matrigelt (2-3 mg/ml fehérje) az egyes sejtkútbetétek közepére. Óvatosan terítse el a Matrigelt a membrán teljes felületén.
2. Tegye a bevont betéteket az inkubátorba, hogy a Matrigel 20-30 percig megszilárduljon.

A sejtek előkészítése a vizsgálathoz:

1. Kezelje és növessze a sejteket a kísérleti feltételeknek megfelelően. Kívánatos lehet a sejteket azonos növekedési állapotba szinkronizálni.
2. Tripszinálás és a sejtek megszámlálása
3. Vegyük ki a tripszint és szuszpendáljuk újra friss tápfolyadékkal.
4. Tegyen 1X105 sejtet 200 μl meghatározott tápfolyadékban a felső kamrába.
5. Adjunk hozzá 300 μl médiumot az alsó kamrába.
6. Kultúrázzon körülbelül 20 órán keresztül.

Az idő a különböző sejtvonalak esetében változik, és a kevésbé invazív sejtek esetében akár 48 óra is lehet.

Fixálás és festés:

1. A tenyésztés után szívja le a tápfolyadékot az alsó kamrából
2. Adjon hozzá 0,5 ml 5% glutaraldehidet 1XPBS-ben, inkubálja 10 percig. @ R.T
3. A Glutaraldehid oldatot szellőztesse ki, mosson minden lyukat 3-szor D.W-vel
4. Adjon 0,5 ml 0,5%-os toluidinkék festőoldatot az alsó kamrába, inkubálja 10-20 percig @ R.T
5. Az oldatot mind a felső, mind az alsó kamrából kiszellőztetjük, az alsó kamrát 3-szor átmossuk D.W-vel
6. A felső kamra belső felületét vattakoronggal óvatosan áttöröljük. (Vigyázzon, hogy ne nyomja túl erősen, a membrán kipattanhat.) A behatolt sejtek a membrán aljának közepén lesznek.
7. Mérje meg a sejtek számát a mikroszkóp q 20X objektívjével. Számoljon meg membránként legalább 3 mezőt.