Abstract
Háttér. Az amiloidózis saját eredetű eozinofil hialin anyag extracelluláris kicsapódása, speciális festési jellemzőkkel és fibrilláris ultrastruktúrával. A makuláris amiloidózis a bőrre korlátozódik, és patogenezisére számos tényezőt javasoltak. Az Epstein-Barr-vírus (EBV) DNS kimutatása ebben az elváltozásban arra utal, hogy ez a vírus szerepet játszhat a betegség patogenezisében. Célkitűzés. Az EBV-DNS kimutatását 30, makuláris amyloidózis diagnózisával rendelkező bőrmintán és 31 egészséges bőrmintán végeztük el PCR segítségével az eltávolított melanocytás naevusok margóján. Eredmények. A béta-globin génre PCR-rel pozitív betegeknél az EBV-vírus BLLF1 génje 23 betegnél volt pozitív (8 beteg az eset- és 15 beteg a kontrollcsoportban). Nem volt szignifikáns különbség az EBV-DNS jelenlétében a makula amyloidosis (3,8%) és a kontroll (23,8%) csoportok között (). Következtetés. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az EBV nem játszik szerepet a makuláris amyloidosis patogenezisében.
1. Bevezetés
Az amiloidózis egy csoport rostos fehérje extracelluláris lerakódása. Az amiloidózis osztályozására többféle megközelítés létezik, de a legegyszerűbb módszer a szisztémás és szervspecifikus (lokalizált) típusokra való felosztás. A bőr mindkét típusban érintett szövet. A bőrre lokalizált amiloidózisnak két típusa van: (i) keratinos, amely lehet elsődleges vagy másodlagos, és (ii) noduláris. A másodlagos típus más bőrelváltozások, például bőrdaganatok, gyulladásos bőrbetegségek és fényterápia következtében alakul ki. A keratórikus amiloidózisnak két típusát azonosították: a makuláris és a lichen amiloidózist, és az utóbbi a gyakoribb. A keratózisos amiloidózisban a bazális keratinocitákból származó keratinlerakódások főként CK5-pozitívak. A keratózisos típus leginkább Délkelet-Ázsiában, Dél-Amerikában és Kínában figyelhető meg. Van familiáris (10%) és sporadikus formája, és az utóbbi gyakrabban fordul elő nőknél . Az érintettség leggyakoribb helye a hát felső része (interskapuláris terület) és a végtagok (lábszár és karok), bár az arcon, a törzsön és a combokon is leírták már . A makuláris amyloidózis elváltozásai általában szürkésbarna makulákból álló, hiperpigmentált, határozatlan szélű, gyakran hálózatos vagy hullámos megjelenésű foltok formájában jelennek meg (1. ábra). A viszketés gyakori tünet az amiloidózis kialakulása előtt .
Ez a betegség patogenezise nem teljesen tisztázott, kivéve azt a tényt, hogy a lerakódott keratin a keratinocitákból származik . Két patogenetikai mechanizmust javasoltak, köztük az apoptotikus (fibrilláris) elméletet és a szekréciós elméletet . Az apoptotikus elmélet alapján a bazális rétegben a károsodott keratinociták degenerációját ezeknek a kolloidtesteknek a bőr histiociták és fibroblasztok általi átalakulása követi amiloiddá a papilláris dermiszben (2. ábra). A szekréciós elmélet szerint a degenerált bazális keratinocitákból származó amiloid lerakódások a sérült lamina densa-n keresztül a papilláris dermiszbe terjednek. A makuláris amyloidosis patogenezisében számos etiológiai tényezőt feltételeznek: faji tényezők , genetikai hajlam, környezeti tényezők , nem (női) , női hormonok , napfénynek való kitettség , súrlódás (hosszú távú kopás) , atópia , autoimmunitás (a szisztémás lupus erythematosusszal, dermatomyositisszel, szisztémás szklerózissal, szarkoidózissal és IgA nefropátiával való összefüggés alapján) , és EBV fertőzés . Az EBV, amelynek jelenlétéről a makuláris amyloidózis epidermiszében már beszámoltak, valószínűleg a keratinociták degenerációjához hozzájáruló tényezőként hat .
Az EBV szerepét a primer cutan amyloidosis etiopatogenezisében mindössze két korábbi tanulmányban értékelték, köztük egyetlen esetismertetésben és egy 27 kínai betegből álló esetsorozatban . Tekintettel az EBV és a makuláris amyloidosis közötti kapcsolatra vonatkozó tanulmányok hiányára, célul tűztük ki egy erre vonatkozó tanulmány elvégzését Iránban. Talán antivirális szereket lehet használni a jövőben ennek a betegségnek a kezelésére az EBV-vel való társulás esetén.
2. Anyagok és módszerek
Ebben az eset-kontroll vizsgálatban 38 makuláris amyloidózisos és 38 egészséges bőrmintát vontak be a klinikai vizsgálatba nem véletlenszerű, objektív irányultságú mintavétel alapján kivágott melanocita naevusok körül korban és nemben illeszkedő, makuláris amyloidózis nélküli betegektől. A felvételi kritériumok közé tartoztak a mashhadi Imam Reza Kórház patológiai osztályának archívumában található, a patológiai jelentés és a klinikai megjelenés alapján makuláris amiloidózissal diagnosztizált, elegendő szövetet tartalmazó paraffinblokkok. A kizárási kritériumok közé tartoztak a nyilvántartásban hiányos adatokkal rendelkező blokkok és a PCR-hez elégtelen minták.
Az esetcsoportban az amiloidlerakódást optikai mikroszkópiával és Congo-vörös festéssel igazolták. A következő lépésben steril körülmények között, steril pengével hat darab 5 μm-es metszetet készítettünk az eset- és a kontrollcsoportok blokkjaiból, amelyeket steril Eppendorf-csövekbe helyeztünk.
2.1. Az eset- és a kontrollcsoport blokkjaiból steril körülmények között hat darab 5 μm-es metszetet készítettünk. Deparaffinizálás
Xilol/etanolt használtunk a paraffinizált szövetek deparaffinizálásához. A szövetmetszeteket tartalmazó mikrocsövekhez egy mL xilolt adtunk, és szobahőmérsékleten, állandó rázogatás mellett fél órán át inkubáltuk. A következő lépésben a mikrocsöveket 13 000 fordulat/perc fordulatszámon 10 percig centrifugáltuk, és a felülúszót elvetettük. Ezt a két lépést egyszer megismételtük. Ötszáz μL 100%-os etanolt adtunk a csapadékhoz, és a mikrocsövek többszöri megfordítása után 10 m-en át 13 000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk. Ezt a lépést ismét megismételtük. Végül az így kapott csapadékot szobahőmérsékletre helyeztük, hogy az etanol teljesen elpárologjon, de a csapadék nem.
2.2. DNS extrakció
A DNS extrakciót a BIO BASIC INC (Kanada) 8401-140116 tételszámú kitjével végeztük. Az extrakcióhoz Lysis puffer-T-t használtunk. A következő lépésben 100 μL extrakciós puffert és 10 μL proteináz K-t adtunk minden mikrocsőbe, majd összekevertük. A szövetmintákat a keverékhez adtuk, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a mintákat 95°C-on inkubáltuk 3 percig a proteináz K inaktiválása érdekében. 100 μL univerzális NST puffert adtunk a csövekhez, és 10-szer megfordítottuk. A kapott keveréket használtuk fel a PCR-hez.
2.3. PCR
Ebben a vizsgálatban PCR-t alkalmaztunk az EBV genom jelenlétének kimutatására a makuláris amyloidózisban. A paraffinizált blokkokból történő DNS-extrakciót követően a paraffinba ágyazott szövetekből kivont DNS minőségét béta-globin génprimerek segítségével határoztuk meg. Az ebben a vizsgálatban használt GH20 és PC04 béta-globin gén primerek 260 bp fragmentumot amplifikáltak. E primerek szekvenciája a következő volt: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.A 260 bp fragmentumot produkáló mintákat a kívánt primerek használatával az EBV-vírus BLLF1 génjének amplifikációja szempontjából kedvezőnek tekintettük.
Az EBV-szekvencia jelenlétét a kivont DNS-mintákban a 935701 tételszámú Cinna Gen kit (Sina Clon, Irán) segítségével vizsgáltuk. Ezt a kitet az EBV DNS minőségének meghatározására tervezték a fertőzött mintákban PCR segítségével. Az optimalizált 1x PCR, mint rekombináns Taq DNS-polimeráz, PCR-puffer, MgCl2, dNTP-k és primerek keveréke volt a keveréshez használt reagens. A BLLF1 gén gp 350/220-at kódoló, igen specifikus és repetitív régióját amplifikálták a primerek. Ezek legalább 30 EBV-kópiát képesek kimutatni. A 239 bp vagy 256 bp fragmentumok jelenléte pozitív teszteredményt jelez.
Az adatok elemzését SPSS 11.5 szoftverrel végeztük. Az adatok leírására grafikonokat és statisztikai táblázatokat használtunk, az egészséges és a beteg mintákban lévő EBV összehasonlítására pedig Chi-négyzet és független -próbákat alkalmaztunk. Minden tesztben a 0,05-ös szignifikancia szintet vettük figyelembe.
3. Eredmények
A betegek 50%-a férfi (19/38) és 50%-a nő (19/38) volt. Három beteg tartozott a 20 év alatti korcsoportba (7,9%), 5 beteg 20-30 éves (13,2%), 10 beteg 30-40 éves (26,3%), 13 beteg 40-50 éves (34,2%), 4 beteg 50-60 éves (10,5%) és 3 beteg 60 év feletti (7,9%). A minimális és maximális életkor 19, illetve 76 év volt. A fertőzés 27 esetben a törzsben (71,1%) és 11 esetben a végtagokban (28,9%) jelentkezett. A vizsgálati és a kontrollcsoport életkor () és nem () tekintetében megfelelt. 76 mintában (38 eset és 38 kontroll) végeztek béta-globin génre vonatkozó PCR-t. A vizsgálat 61 mintában (30 minta az esetcsoportban és 31 a kontrollcsoportban) pozitív, 15 mintában (8 minta az eset- és 7 a kontrollcsoportban) negatív volt (3. ábra).
A béta-globin génre PCR-rel pozitív 61 mintában az EBV-ből származó BLLF1 gén 23 esetben volt pozitív (8 esetben a vizsgálati csoportban és 15 esetben a kontrollcsoportban), 38 esetben pedig negatív (22 esetben a vizsgálati csoportban és 16 esetben a kontrollcsoportban) (4. ábra).
Az EBV BLLF1 génjének PCR-je 26,7%-ban pozitív volt a vizsgálati csoportban és 48,4%-ban pozitív a kontrollcsoportban. A Chi-négyzet teszt eredményei nem mutattak összefüggést az EBV és a makula amyloidosis között () (1. táblázat).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Megbeszélés
Az amiloidózis saját eredetű eozinofil hialin anyag extracelluláris lerakódásaként ismert, specifikus festési és ultrastrukturális jellemzőkkel. Ez a rendellenesség előfordulhat szisztémás betegségek hátterében, vagy a bőrre korlátozódhat. A makuláris amiloidózis a bőrre korlátozódik . Az EBV serkentheti a keratinociták amiloid anyagának kiválasztását, vagy serkentője lehet a keratinociták degenerációjának és a degenerált keratinocita filamentumok amiloiddá történő átalakulásának . A legújabb tanulmányok rámutattak a hámsejtek szerepére az EBV folyamatos szaporodásában. A kevésbé differenciált laphámban talált EBV-sejtfelszíni receptorok az epidermális keratinociták közvetlen fertőzésére utalnak. A fertőzés a csírázó rétegekben is előfordulhat; a vírusszaporodás azonban csak a sejtek érése és differenciálódása révén lehetséges. A citokeratin expressziója a humán keratinocitákban in vitro megváltozik az EBV-vel való fertőzést követően, ami fibroblasztokká való átalakulásukat eredményezi . A fibroblasztok képesek a keratin aggregátumokat fagocitálni és amiloiddá alakítani .
Drago és munkatársai 1996-ban Olaszországban kimutatták ezt az összefüggést. Páciensük egy 30 éves nő volt, akinek tíz éve viszkető barna papulák és makulák jelentek meg a mellkasán és a hátán, krónikus fáradtság szindróma tüneteivel. In situ hibridizációs technikával ki tudták mutatni az EBV genomot az epidermális elváltozásokban. Az EBV genomot elsősorban a bazális epidermális sejtekben, valamint a magasabb réteg sejtjeiben mutatták ki, különösen a citoplazmában. Az EBV szerológiai tesztek is pozitívak voltak a betegnél. Az aciklovirral és interferon alfával végzett antivirális terápia javította a beteg bőrelváltozásait és általános tüneteit . Egy másik vizsgálatot Chang és munkatársai végeztek 27 beteg bőrszövetén, akiknél 1997-ben Tajvanon lichen és makuláris amyloidózist diagnosztizáltak. Az in situ hibridizációs módszer 11 beteg (40,7%) léziójában mutatott ki EBV-DNS-t, míg a kontrollcsoportban (amely három másodlagos cutan amyloidosisban szenvedő beteget, két primer szisztémás amyloidosisban szenvedő beteget és négy krónikus simplex lichenes beteget tartalmazott) nem volt EBV-DNS .
A vizsgálat szerint nem volt összefüggés az EBV és a makuláris amyloidosis között (). Vizsgálatunkban 8 makuláris amyloidosisban szenvedő betegnél és 15 kontrollnál volt jelen EBV-DNS. Az EBV-DNS kimutatási aránya közötti különbség a makuláris amyloidózisos betegek és a kontrollok között ebben a tanulmányban és az említett tanulmányokban a következő okokra vezethető vissza:(1)A makuláris amyloidózis és az EBV-fertőzés közötti összefüggés hiánya: néhány tanulmány nem mutat be elegendő bizonyítékot az EBV és a makuláris amyloidózis közötti végleges összefüggésre, így tanulmányunk eredményei alapján ezt a következtetést vonhattuk le.(2)Módszertan (PCR versus in situ hibridizáció): az EBV-DNS kimutatására érzékeny módszert használtunk pozitív és negatív kontrollokkal. A korábbi vizsgálatok alapján a PCR ugyanolyan érzékeny, mint az in situ hibridizáció . Mivel azonban nem alkalmaztunk in situ hibridizációt, nem tudtuk pontosan lokalizálni az EBV-vel fertőzött sejteket a kontrolljainkban, amelyek a keratinociták helyett a bőr keringő B-sejtjei lehetnek. Mivel az EBV-re vonatkozó PCR-készletünkben pozitív és negatív kontrollokat használtunk, a kontrollcsoportunkban a pozitív esetek nem lehettek álpozitívak. 3) Kontrollok: vizsgálatunkban a kontrollok a melanocitás naevi körüli egészséges bőr volt, de Chang vizsgálatában a kontrollok más bőrbetegségek voltak. 4) A bőr amyloidózis típusa: vizsgálatunkban minden betegnek makuláris amyloidózisa volt, de mindkét korábbi vizsgálatban a legtöbb betegnek lichen amyloidózisa volt.
5. Következtetés
A vizsgálat eredményei szerint nem volt összefüggés az EBV és a makula amyloidosis között. Javasoljuk friss szövet vagy gyorsan lefagyasztott biopsziacsonk használatát, valamint a betegek egyidejű szerológiai vizsgálatát EBV-ellenes antitestre, hogy pontosabb eredményeket kapjunk az EBV-DNS összehasonlító vizsgálatához a makula amyloidosisban. In situ PCR is használható az EBV-DNS pozitív sejtek lokalizálására a mintákban. Más gének is használhatók az EBV kimutatására a szövetekben, mivel néhány EBV-mintában mutálódott az ebben a vizsgálatban használt BLLF1 gén .
Az EBV kimutatására vonatkozó összehasonlító vizsgálat elvégzését javasoljuk a makuláris amyloidózisban szenvedő betegek érintett és nem érintett bőrében is.
Érdekellentét
A szerzők nem nyilatkoznak érdekellentétről.
Köszönet
A szerzők mély hálájukat fejezik ki a MUMS kutatási helyettesének a pénzügyi támogatásért és a Narges Nazeri szakdolgozatához kapcsolódó kutatási javaslat (no. 911283) jóváhagyásáért. A Mashhadi Orvosi Tudományok Egyetemének kutatási helyettese által nyújtott pénzügyi támogatást köszönjük.