Introduction

A nátrium-azid (NaN3) fehér, színtelen és kristályos por formájában erősen toxikus anyagnak minősül. Mérgező hatása hasonló a cianidéhoz, és károsítja az ideg- és szív- és érrendszert, a szemet és a bőrt. Ez a toxikus elem a lenyelést követően gyorsan aktívvá válik, és fő hatásai a szájon át történő bevitelt követően néhány órával jelentkeznek, a bevitt mennyiségtől függően (1,2). A NaN3-nak való kitettség perceken belül számos tünetet okozhat, beleértve a hányingert, hányást, fejfájást, nyugtalanságot, szédülést, gyengeséget, szapora légzést és szapora szívverést (3). E mérgező elem nagy mennyiségei azonnal görcsöket, eszméletvesztést, alacsony pulzusszámot és vérnyomást, valamint légzési elégtelenséget idéznek elő, ami végül halálhoz vezet (3). A NaN3 bizonyított hatásmechanizmusai közül a legfontosabb a citokróm-oxidáz-légzési lánc komplex gátlása (4). Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a NaN3, a IV. komplex (Cox IV) gátlója, apoptózist indukálhat primer agykérgi neuronokban, amely kaszpáz-3 függő és a citokróm c felszabadulásával jár együtt (5).

A mitokondriális bioszintézisben a Cox IV légzési lánc promóterét a nukleáris respirációs faktorok (Nrf)-1/2 aktiválhatják. Ezzel párhuzamosan az Nrf a mitokondriális A(Tfam) transzkripciós faktort kódoló gének aktivitásának szabályozásával állítható be, hogy közvetve szabályozza a légzési lánc gének expressziós szintjét. Az Nrf-1/2, a Tfam, a peroxiszóma proliferátor aktivált receptor γ koaktivátor 1-α (Pgc-1α) és más koaktivátorok alkotják a Pgc-1α jelkaszkádot, amely központi szerepet játszik a mitokondriális biogenezis és a légzési funkció transzkripciós szabályozását szabályozó szabályozó hálózatban. Ebben a jelláncban a Pgc-1α először aktiválja az Nrf-1/2-t, szemben a mitokondriális DNS-hez való közvetlen kötődéssel, és az Nrf-1/2 a Tfam promóterével együtt indukálja a Tfam aktiválását, és elindítja a mitokondriális DNS átírását és replikációját, ami a mitokondriális fehérjék expressziós szintjének növekedéséhez vezet(6). Ezzel párhuzamosan a Pgc-1α aktiválódhat CaN-, Ca2+/kalmodulinfüggő proteinkináz (CaMK)-, mitogén-aktivált protein kináz (MAPK)- és ciklinfüggő kináz által közvetített jelátviteli utakon (7). A jelen vizsgálatban PC12 sejteket használtunk fel dopamin neuron modell létrehozására, és megvizsgáltuk a NaN3 hatását és mechanizmusát a Pgc-1α-hez kapcsolódó útvonalakra aPC12 sejtekben, hogy azonosítsuk, hogy a NaN3 okoz-e toxicitást a tenyésztett PC12 sejtekben, valamint az e hatások hátterében álló mechanizmusokat.

Anyagok és módszerek

Anyagok

A PC12 sejteket a Kínai Tudományos Akadémia Típuskultúra-gyűjteményének sejtbankjából (Sanghaj, Kína) vásárolták. A NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Németország) törzsoldatát steril sóoldatban oldottuk fel, hogy 1 M törzsoldatot készítsünk, amelyet a kísérlet előtt a kívánt koncentrációra hígítottunk. Egylépéses TUNEL Apoptosis Assay kit (C1090), Annexin V-fluoreszcein-izotiocianát (FITC) Apoptosis Detection kit (C1063), Enhanced adenozin 5′-trifoszfát (ATP) Assay kit (S0027), JC-1 Mitokondriális Membránpotenciál Assay kit (C2006) és Reaktív Oxigén Species Assay kit (S0033) aBeyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kína) biztosította.

Cellakultúra és életképességi vizsgálat

A PC12 sejteket Dulbecco módosított sas médiumban (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) tartottuk, 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) kiegészítve, Waltham, MA, USA) és 1%-os antimikotikus antimikotikus oldattal, amely 10 000 U penicillinből és 10 000 U streptomicinből áll. A sejteket 37°C-on inkubáltuk 5% CO2 -os párásított légkörben, és mindig70-80%-os konfluenciában használtuk.

A PC12 sejtek életképességét aCell Counting Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, Kína) segítségével határoztuk meg. A sejteket 96 lyukú lemezekbe vetettük 1×105/lyuk sűrűséggel. 24 órás tenyésztés után a sejteket NaN3-mal (0-80 mM) kezeltük, és 12, 24, 48 és 72 órán át inkubáltuk a sejtkárosodási modell létrehozásához. Ezt követően 10 µlCCK-8 oldatot (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) adtunk minden lyukhoz, és további 2 órán át inkubáltuk standard körülmények között (37°C és 5% CO2). A 450 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciát ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) segítségével határoztuk meg. A sejtéletképességet 6 lyuk átlagos optikai sűrűsége alapján számoltuk ki. A kísérleteket három példányban végeztük. A sejtéletképességi vizsgálatok eredményei alapján határoztuk meg a NaN3 megfelelő koncentrációját a későbbi kísérletekhez.

A DAPI-val festettPC12 sejtek nukleáris morfológiája

APC12 sejteket 0, 10, 20 és 40 mMNaN3-nak tettük ki 24 órán keresztül. A programozott sejthalál és a nem apoptotikus sejthalál megkülönböztetése érdekében a sejtmagokat 10µg/ml DAPI-val (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology) festettük. Röviden, a sejteket kétszer mostuk PBS-szel, majd 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk szobahőmérsékleten 30 percig. Három mosást követően a fixált sejteket 5 percig DAPI-val (1:5 000) festettük, majd PBS-szel mostuk. A fluoreszcens képeket Leica DMI fluoreszcens mikroszkóppal készítettük (nagyítás, ×400).

Az apoptotikus ráta mérése

A sejtek apoptózisának meghatározására Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kitet (Beyotime Institute of Biotechnology) használtunk a gyártó utasításainak megfelelően.A kísérleteket három példányban ismételtük és az alábbiak szerint végeztük: A kontroll PC12 sejtek (0 mMNaN3) és a 10, 20 és 40 mMNaN3-nak 24 órán keresztül kitett PC12 sejtek apoptotikus arányát áramlási citometriával (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA) mértük. A statisztikai elemzéseket az SPSS statisztikai szoftver v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA) segítségével végeztük.

A mitokondriális membránpotenciál (ΔΨm)

ΔΨm a mitokondriális működés egyik jelentős paramétere. Ezt JC-1 fluoreszcens szondával történő festéssel határozták meg. A kísérleteket három példányban ismételtük meg, és a következőképpen végeztük: A kontroll PC12 sejteket 0 mM NaN3-mal kezeltük; és a kísérleti PC12 sejteket 10, 20 és 40 mM NaN3-nak tettük ki 24 órán keresztül. Ezt követően a gyártó protokollja szerint (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kína) a sejteket 37°C-on 20 percig inkubáltuk a JC-1-et (1X) tartalmazó médiummal, majd a sejteket háromszor mostuk mosópufferrel és friss, szérummentes médiummal gyűjtöttük. Ezzel párhuzamosan a pozitív kontrollt karbonyl-cianid3-klórfenil-hidrazon (CCCP) inhibitorral (10 µM) kezeltük 37°C-on 20 percig. Ezután a vörös/zöld fluoreszcenciát FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.) segítségével határoztuk meg. A vörös fluoreszcencia intenzitásának és a zöld fluoreszcencia intenzitásának aránya a ΔΨm szintjét jelentette.

A reaktív oxigénfajok (ROS) termelésének mérése

A PC12 sejtekben lévő ROS-t a ReactiveOxygen Species Assay kit (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Kína) segítségével mértük. Az intracelluláris ROS-termelődést 2′,7′-diklórfluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) fluoreszcens szondával vizsgálták. Az intracelluláris ROS oxidálja a DCFH-DA-t, ami a 2′,7′-diklór-fluoreszcein (DCF) fluoreszcens vegyületet eredményezi, és a DCF-fluoreszcencia intenzitását a ROS-mérő készlet utasításai szerint a képződött ROS mennyiségével párhuzamosnak tekintik.A kísérleteket három példányban megismételtük és a következőképpen végeztük: a pozitív kontrollt Rosup specifikus koncentrációjával kezeltük (50 mg/ml); a kontroll PC12 sejteket 0 mM NaN3-mal kezeltük; és a kísérleti PC12 sejteket 10, 20 és 40 mM NaN3-nak tettük ki 24 órán keresztül. Ezen kívül a PC12 sejteket szérummentes DMEM-ben (1:1.000) oldott DCFH-DA-val (10 mM) kezeltük 20 percig 37°C-on, majd háromszor mostuk szérummentes DMEM-mel. A pozitív kontrollt Rosuppal kezeltük a ROS-termelés indukálása érdekében. A ROS-termelődést FCM (FC500;Beckman Coulter, Inc.) segítségével határoztuk meg. Az átlagos fluoreszcencia-intenzitások (MFI)a ROS-szinteket jelentették.

A sejtek ATP-tartalmának mérésePC12 sejtekben

A kísérleteket három példányban ismételtük és a következőképpen végeztük: Ezt követően a sejtek ATP-tartalmát aFirefly Luciferase ATP Assay kit (Beyotime Institute ofBiotechnology) segítségével határoztuk meg a gyártó protokollja szerint.

Western blot analízis

A PC12 sejteket 24 órán keresztül 0, 10, 20 és 40 mMNaN3-nak tettük ki, radioimmunoprecipitációs assaylysis pufferben (Beyotime Institute of Biotechnology) lizáltuk, amely aproteáz inhibitort tartalmazott, és 13,362 × g-n 10 percig 4°C-on centrifugáltuk a felülúszók összegyűjtése érdekében. Ezt követően a fehérjekoncentrációt BCA kit (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.) segítségével határoztuk meg. Egyenlő mennyiségű fehérjéket (90 µg) 10 és 12%-os SDS-PAGE-nak vetettünk alá, majd polyvinylidenefluorid membránra (0,45 µm) vittük át Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) segítségével. A blokkolást követően 5% szarvasmarha szérumalbuminnal TBS-ben, amely 0.1% Tween-20 (TBST) 2 órán keresztül szobahőmérsékleten, a membránokat a Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam; 1:1.000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc.) elleni elsődleges antitestekkel inkubáltuk, Danvers, MA, USA, 1:500), pán-kalcineurin A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1.000), foszforilált (p)-CaMKII (Cell Signaling Technology; 1:1.000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1.000), p-extracelluláris jel-szabályozott kináz (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), B-sejtes limfóma-2 (Bcl-2)-asszociált X fehérje (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) és citokróm c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) 4°C-on egy éjszakán át. A membránokat ezután TBST-vel mostuk és ló-gyökérperoxidázzal (HRP) konjugált másodlagos antitestekkel (nyúl; kat. sz. A0208; 1:1 000; vagy egér; kat. sz. A0216; 1;1 000; mindkettő Beyotime Instituteof Biotechnology) 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. Az immunreaktív sávokat az erősített kemilumineszcens rendszerrel (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Kína) vizualizáltuk és kvantitatívan elemeztük az Image J l.32 J verziójával (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), és a β-aktint választottuk terhelő kontrollnak.

Statisztikai elemzés

Minden statisztikai elemzést SPSSstatistical software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) segítségével végeztünk. Az adatokat átlag ± standard eltérés standard hibája az átlagnak. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját egyirányú varianciaanalízissel, majd Bonferroni post-hoc tesztekkel határoztuk meg. A P<0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikáns különbségnek. Minden kísérletet legalább háromszor megismételtünk.

Eredmények

A NaN3 gátolja aPC12 sejtek növekedését

A NaN3 expozíció hatását a PC12 sejtek proliferációjára CCK-8 teszttel vizsgáltuk. A sejteket különböző koncentrációjú (0-80 mM) NaN3-mal kezeltük 12-72 órán keresztül. Az I. táblázat és az 1A-D ábra azt mutatja, hogy a sejtek életképességét a NaN3 koncentrációfüggő módon csökkentette. A sejtek majdnem 100%-a elpusztult a 80 mM NaN3 72 órás expozícióját követően, ami azt jelzi, hogy a NaN3 jelentősen kiváltotta a sejthalált, és a NaN3 citotoxicitása dózis- és időfüggő módon volt kimutatható. A 20 mM-os NaN3-koncentráció 24 órán keresztül történő expozíciója aPC12 sejtekben kifejezett sejthalált okozott (50%). Ezért a 24 órán keresztül tenyésztett sejteket használtuk fel a további kísérletekhez.

Cellamorfológia

A PC12-sejtek morfológiai változásait DAPI-festéssel, fluoreszcens mikroszkópiával figyeltük meg a NaN3 különböző koncentrációinak expozícióját követően. A NaN3-nak 24 órán keresztül kitett sejtmagok fragmentálódását figyelték meg, és a sejtmagok zsugorodása és a kromatin kondenzációja enyhén nőtt a NaN3 koncentrációjával a PC12 sejtekben a kontrollhoz képest. Ezekben a sejtekben az apoptotikus sejtek kisebbek és fényesebbek voltak a normál sejtekhez képest. Kromatin-kondenzációt és magfragmentációt is megfigyeltek, míg a kontrollcsoportban az életképes sejtek kék sejtmagjait azonosították.Ezenkívül az apoptotikus sejtek száma és a zöld fluoreszcencia intenzitása megnőtt a NaN3-nak kitett sejtekben (2. ábra).

Apoptotikus arány meghatározása Annexin V-FITC festéssel

A halott sejtek vagy késői apoptotikus sejtek, amelyek elvesztették a sejtmembrán integritását, propidium-jodiddal festhetők. A sejtmembrán integritásának elvesztése miatt az Annexin V-FITC bejuthat a citoplazmába és egyesülhet a sejtmembrán belsejében lévő foszfatidil-szerinnel, zöld fluoreszcenciát mutatva az elhalt sejtekben.A 3. ábra mutatja, hogy az apoptotikus sejtek száma 5,03, 8,02, 43,77 és 78,67% (P<0,05) volt a PC12 sejtekben, miután 24 órán keresztül különböző koncentrációjú (0, 10, 20 és 40 mM) NaN3-nak volt kitéve. Ezek az eredmények továbbá megerősítették, hogy a NaN3 dózisfüggő módon indukálta a sejtek apoptózisát.

A mitokondriális membránpotenciál változásai (ΔΨm)

A mitokondriumokat általában a sejtek életképességében részt vevő kulcsfontosságú szabályozóorganelláknak tekintik. Ezért a ΔΨm-t a mitokondriumok működésének indikátoraként használták. A PC12 sejteket JC-1-gyel festették meg, egy kationos festékkel, amely potenciálfüggő felhalmozódást mutat a mitokondriumokban. A NaN3 növekvő koncentrációjának kitett kis számú sejtben vörös fluoreszcenciát (J-aggregátumok) figyeltünk meg, amely stabil membránpotenciállal rendelkező aktív mitokondriumokat jelent. Ezzel szemben számos sejtben zöld fluoreszcencia (J-monomer) volt megfigyelhető, amely apoptotikus mitokondriumokat jelent, sérült ΔΨm-mel. A piros és zöld fluoreszcencia aránya fokozatosan csökkent a kontrollcsoportban (4. ábra).

NaN3 által indukált mitokondriális ROS felhalmozódás

Azt jól tudjuk, hogy a mitokondriumok a sejt ROS elsődleges forrásai, és a ROS fontos szerepet játszik az apoptotikus jelátvitel aktiválásában. Ezért a ROS szerepét aNaN3 által kiváltott PC12 sejthalálban további vizsgálatokkal vizsgáltuk. Az 5. ábra azt mutatja, hogy a fluoreszcencia intenzitása a kontroll sejtekben és a különböző koncentrációjú (0, 10, 20 és 40 mM) NaN3-nak 24 órán keresztül kitett sejtekben 3,65, 6,99, 18,63 és 39 volt.35, ami azt jelzi, hogy a NaN3-expozíció jelentősen megnövelte a mitokondriális ROS-termelődést a kontrollcsoporthoz képest (P<0,05). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a NaN3-indukáltapoptózis javította az intracelluláris ROS termelését.

A NaN3 lecsökkenti a sejtek ATP-jének titokondriális energiatermelését

A NaN3-nak kitett PC12 sejtek ATP-tartalmának értékeléséhez a relatív lumineszcencia egységet (RLU) kvantitatív módon határozták meg luminométerrel. A 6. ábra azt mutatja, hogy a NaN3gátolta a mitokondriális ATP-termelést és fokozatosan csökkentette a celluláris ATP-szintet (P<0,05).

A Pgc-1α és az apoptózissal kapcsolatos fehérjék expressziós szintje PC12 sejtekben

A Pgc-1α fehérjeszintű expressziója szignifikánsan csökkent a NaN3-expozíciót követően a kontrollhoz képest (P<0,05). Ezenkívül az Nrf-1, a Tfam, a p-Erk1/2, az Nrf-2 és a Cox IV jól ismert downstream célpontjai a Pgc-1αdinamikának különböző sejttípusokban (8). A jelen vizsgálat azonosította, hogy a NaN3-expozíció jelentősen gátolta a Pgc-1α dinamikát dózisfüggő módon (P<0,01; 7A ábra).

Mellett a NaN3-expozíció felszabályozta a Bax és a citokróm c expressziós szintjét, míg a Bcl-2 és a prokaszpáz-3 expressziós szintjét szabályozta le (P<0,05). A Bax/Bcl-2 aránya is jelentősen megnövekedett a kontrollcsoporthoz képest (P<0,05; 7B ábra).

A többi fontos tag, köztük a CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK és p-p38 MAPK fehérje expressziós szintjét is felmértük. Az eredmények azt mutatták, hogy a NaN3növelte a CaN expresszióját és a CaMKII és a p38 MAPK foszforilációját a kontrollcsoporthoz képest, míg a teljes CaMKII és a p38 MAPK expressziós szintje nem változott. Ezenkívül a p-CaMKII/CaMKII és a p-p38/p38 MAPK arányai a NaN3 csoportban szignifikánsan megnövekedtek a kontrollcsoportéhoz képest (P<0,01; 7C ábra).

Diszkusszió

Hogy meghatározzuk, hogy a NaN3 gátolta-e a PC12 sejtek proliferációját, a kezelt sejtek számát a logaritmikus fázisban összehasonlítottuk a nem kezelt kontroll sejtek számával. A sejtek növekedése ~75%-kal gátolták a 20 mM NaN3 24 órás expozíciója után. Ezért ezt a koncentrációt használtuk a további kísérletekhez. Az apoptózis magában foglalja a sejtek morfológiájának megváltozását, beleértve a membrán vérzését, a sejtek zsugorodását, a kromatin kondenzációját, a sejtmag fragmentációját és a DNS fragmentációját(9). Az apoptózis nukleáris morfológiájának és az apoptotikus ráta további elemzéséhez a sejteket 24 órán keresztül 0, 10, 20 és 40 mM NaN3-mal kezeltük.A kezelést követően a sejteket DAPI-val és AnnexinV-FITC/PI-vel festettük, és elemeztük a sejtmagok eloszlását. Az eredmények megerősítették, hogy a NaN3-expozíció koncentrációfüggő módon apoptózist indukált a PC12 sejtekben.

A mitokondriumok számos metabolikus funkcióban vesznek részt, beleértve az intracelluláris pH fenntartását és a ROS termelését, amelyek elősegítik és szabályozzák a sejtek apoptózisát (10). A sejt apoptózisának jellemzőit mitokondriális változások előzik meg, beleértve a ΔΨm elvesztését, az energiatermelés (ATP) csökkenését és a mitokondriális membrán permeabilitásának növekedését. Korábbi tanulmányok szerint aROS a mitokondriális légzési lánc károsodását és a ΔΨm elvesztését idézi elő, amelyek a neuronális diszfunkciót közvetítő vagy erősítő tényezők az idegrendszeri degeneráció során, és következésképpen az idegrendszeri degeneratív betegségek kialakulásához vezetnek (11,12).A NaN3 a mitokondriális membrán permeabilitási potenciáljának lipidperoxidáción keresztül történő növelése révén ismerten degenerációt és excitotoxicitást okoz (13-15), és a NaN3 elsődleges toxikus hatását a mitokondriális elektrontranszportláncban a citokróm-oxidáz működésének gátlásával és az ATP-termelés megakadályozásával fejti ki (4). A jelen vizsgálatban FCM-et használtunk a PC12 sejtek ΔΨm és ROS-termelésének azonosítására. Ezenkívül megvizsgáltuk a mitokondriumokban az ATP-szintézist a NaN3 különböző koncentrációinak expozícióját követően. A plazmamembrán felbomlása, a mitokondriális ROS-termelés növekedése és a sejtek ATP-tartalmának megfigyelt csökkenése arra utalt, hogy a NaN3-expozíció apoptózist indukált a PC12 sejtekben.

A mitokondriális sejthalált többféle inger is aktiválhatja, beleértve a fejlődési programot, a DNS-károsodást, az endoplazmatikus retikulum stresszt, a növekedési faktor- és tápanyagmegvonást, a vírusfertőzést és az oxidatív stresszt (16). A nukleáris társszabályozók egyre növekvő családjának tagjaként a Pgc-1α számos gént aktiválhat és szabályozhatja az energiaanyagcserében részt vevő gének expressziós szintjét olyan jelátviteli utakra válaszul, amelyek a termogenezist, a glükoneogenezist, az izomrost-típusváltást és a mitokondriális biogenezist közvetítik (17).Ezek a társszabályozók nagy multifehérje-komplexekben léteznek és működnek, amelyekben a DNS-hez való kötődés helyett azNrf-1/2-t és a Tfamot szabályozzák, és a géntranszkripció indukciójához vagy repressziójához szükséges későbbi biokémiai kölcsönhatások elősegítésével módosítják transzkripciós hatásukat (8). Ezenkívül az Nrf-1/2 közvetve a mitokondriális DNS-kódolt gének kifejeződését is szabályozza a nukleárisan kódolt Tfam A, B1 és B2 (Tfam,Tfb1m és Tfb2m) potenciális indukciója révén, amelyek a mitokondriális genom transzkripciójának és replikációjának szabályozói (18). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a NaN3 a mitokondriálislégzési lánc IV. komplexének gátlója, amely gyakran érintett az elsődleges mitokondriális rendellenességekben (19,20).Ebben a vizsgálatban először a Pgc-1α jelkaszkád, beleértve a Pgc-1α család fehérjéit (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 és Tfam) és a Cox IV expresszióját vizsgálták PC12 sejtekben annak ellenőrzésére, hogy a jelátviteli események részt vesznek-e a NaN3 által kiváltott apoptózisban. Az eredmények azt sugallták, hogy a NaN3 által kiváltott apoptózis a Pgc-1α családba tartozó fehérjék és a Cox IV expressziós szintjéhez kapcsolódik a mitokondriumok által közvetített jelátviteli útvonalon. Amikor a NaN3 koncentrációját növelték, ezeknek a fehérjéknek az expressziós szintje jelentősen csökkent, ami azt jelzi, hogy részt vehetnek az apoptózis aktiválásában és kialakulásában.

A IV-es komplex ezzel szemben apoptózist válthat ki az elsődleges agykérgi neuronokban, ami kaszpáz3-függő és a citokróm c felszabadulásával jár együtt (5). Jól ismert, hogy a mitokondriumok a sejtek apoptózisának kulcsfontosságú szabályozói. A Bcl-2 család fehérjéi a mitokondriális apoptotikus útvonal fontos kezdeményezői. Ebbe a családba tartoznak a Bax pro-apoptotikus fehérjék, a Bcl-2 homológ antagonista/gyilkos és a Bcl-2-asszociált sejthalál agonista, valamint a Bcl-2 és a Bcl-extra large (Bcl-xL) antiapoptotikus fehérjék. Egészséges sejtekben a Bax egy inaktív citoszolikus fehérje, de az apoptózis során a mitokondriumba transzlokálódik. Pro-apoptotikus hatását úgy fejti ki, hogy pórust képez a mitokondrium külső membránjában, amelyen keresztül a citokróm c a citoplazmába szabadul, ami a kaszpáz 3 aktiválásához vezet (21). Az anti-apoptotikus Bcl-2és Bcl-xL fehérjék elnyomják a Bax funkcióját a mitokondriális membrán integritásának fenntartásával, ami megakadályozza a citokróm cand felszabadulását és a kaszpáz 3 aktiválódását (22). A jelen vizsgálatban a NaN3 növelte a pro-apoptotikus Bax és a citokróm c szintjét, és csökkentette az anti-apoptotikus Bcl-2 és a prokaszpáz-3 szintjét, ami azt jelzi, hogy a NaN3 a PC12 sejtekben amitokondriális apoptózis jelátvitelt indította el.

A Pgc-1α-koaktivátorok expressziós szintje emellett erősen indukálható transzkripciós szinten számos upstream jelátviteli útvonalon keresztül. Például a Pgc-1α expresszióját a testmozgás és a hideg expozíció indukálja a stressz jelátvitel irányítása alatt a celluláris Ca2+ és a ciklikus adenozin-5′-monofoszfát (cAMP) jelátvitelen keresztül (23). A Pgc-1α transzkripcióját a CaMK, a kalcineurin, a β-adrenerg receptor/cAMP és a p38MAPK befolyásolhatja (24-26). Ezenkívül a MAPK családhoz tartozó p38 MAPK kulcsfontosságú szerepet tölt be a sejtproliferációban, a differenciálódásban, az átalakulásban és az apoptózisban, mivel az apoptózis aktiválása közvetlen foszforiláción keresztül indukálhatja a Pgc-1α-t (27). A jelen vizsgálatban a Ca2+ jelátviteli útvonalakon (pán-kalcineurin A és p-CaMKII/CaMKII) és a p38 MAPK útvonalon (p-p38MAPK/p38 MAPK és p-Erk1/2) lévő fehérjék expressziós szintjét vizsgáltuk, hogy megvizsgáljuk a NaN3 hatását az intracelluláris Ca2+homeosztázisra és a p38 MAPK-ra. Az adatok azt mutatták, hogy a pán-kalcineurin A fehérjeszintje, valamint a p-CaMKII/CaMKII és a p-p38MAPK/p38 MAPK arányok megnövekedtek, a p-Erk1/2 szintje pedig csökkent a NaN3-mal kezelt csoportban, ami arra utal, hogy a NaN3 adóz-függő módon kiváltotta a PC12 sejtek apoptózisát, és ez az aktiváció a Ca2+ és a p38 MAPK útvonalakhoz kapcsolódott. Összességében ezek a kísérleti eredmények megerősítették, hogy a NaN3 a Ca2+ és a p38 MAPK útvonalak aktiválásával indukálhatja a PC12 sejtek apoptózisát. Legjobb tudomásunk szerint a jelen vizsgálat mutatta ki először, hogy a NaN3 a PC12 sejtekben aPgc-1α-hoz kapcsolódó jelátviteli utakon keresztül, beleértve aCa2+/p-CaMKII-t és a p38 MAPK-t, indukálta amitokondriumok által közvetített apoptózist.

Összefoglalva, a jelen vizsgálat kimutatta, hogy aNaN3 indukálhatja a PC12 sejtek apoptózisát. A NaN3expozíció mögöttes toxikus mechanizmusának tisztázása érdekében megvizsgáltuk egy sor pro-apoptotikus fehérje (Bax és citokróm c) és anti-apoptotikus fehérje (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII és Pgc-1α) expressziós szintjét. Az eredmények megerősítették, hogy a pro-apoptotikus fehérjék pro-apoptotikus hatást gyakoroltak a PC12 sejtekre a CaMKII és a p38 MAPK aktiválásán és foszforilációján keresztül, ami serkentette a Pgc-1α és a prokaszpáz-3 aktiválódását a PC12 sejtekben. Az adatok alapot nyújtanak a NaN3 hatásmechanizmusait molekuláris szinten vizsgáló későbbi vizsgálatokhoz. A jövőbeni vizsgálatokban a NaN3-kezelést megelőzően védőanyagok, például a mitokondriális osztódás gátló 1, a kinazolinon egy újonnan azonosított mitokondriális osztódás gátló származéka, hozzáadására kerülhet sor annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a védőanyag neuroprotektív hatását a NaN3 által kiváltott apoptózis csillapításában a PC12 sejtekben, és a mögöttes mechanizmus további tisztázása érdekében.

Acknowledgements

Nem alkalmazható.

Finanszírozás

A jelen tanulmányt anyagilag a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (grantno. 81571848) és a Jiangsu Felsőoktatási Intézmények Kiemelt Akadémiai Programfejlesztése támogatta.

Az adatok és anyagok elérhetősége

A jelen tanulmány során felhasznált vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.

A szerzők hozzájárulása

YZ és SZ fogalmazták meg és tervezték a tanulmányt. YZ, JH,HX, TG és YW szerezték az adatokat. YZ, JH és HX elemezték ésértelmezték az adatokat, és elkészítették a kéziratot. Minden szerzőkritikusan átdolgozta a kéziratot, és elolvasta és jóváhagyta a kézirat végleges változatát.

Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez

Nem alkalmazható.

Páciens hozzájárulása a közzétételhez

Nem alkalmazható.

Kompetitív érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincs konkurens érdekük.

Glosszárium

Rövidítések

Rövidítések:

.

.

.aktivált protein kináz

NaN3	nátrium-azid
Cox IV	komplex. IV
Tfam	mitokondriális transzkripciós faktorA
Nrf-1/2	nukleáris respirációs faktor-1/2
CaN	pan-calcineurin A
Pgc-1α	peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α
PC12	patkány fheokromocitóma
ΔΨm	mitokondriális membránpotenciál
CCCP	karbonil-cianid3-klórfenilhidrazon
ROS	reaktív oxigénfajok
FCM	áramlási citometria
MAPK	mitogén

	Herbold M, Schmitt G, Aderjan R és PedalI: Halálos kimenetelű nátrium-azid mérgezés egy kórházban: A preventableaccident. Arch Kriminol. 196:143-148. 1995.(Németül). PubMed/NCBI
	Marquet P, Clément S, Lotfi H, DreyfussMF, Debord J, Dumont D és Lachâtre G: Analytical findings in asuicide involving sodium azide. J Anal Toxicol. 20:134-138. 1996.Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chang S and Lamm SH: Human health effectsof sodium azide exposure: A literature review and analysis. Int JToxicol. 22:175-186. 2003. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Leary SC, Hills BC, Lyons CN, Carison CG,Michaud D, Kraft CS, Ko K, Glerum DM és Moyes CD: Az aziddal való krónikus kezelés in situ a citokróm c oxidáz aktivitás visszafordíthatatlan csökkenéséhez vezet a holoenzim disszociációján keresztül. J BiolChem. 277:11321-11328. 2002. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Grammatopoulos TN, Morris K, Bachar C,Moore S, Andres R és Weyhenmeyer JA: AngiotensinII attenuateschemical hypoxia-induced caspase-3 activation in primary corticalneuronal cultures. Brain Res Bull. 62:297-303. 2004. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Metabolic control ofmitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatorynetwork. Biochim Biophys Acta 1813. 1269-1278. 2011.
	Qian G, Guo JB és Li L: The role ofPgc-1α and mitochondrial regulation in cardiovascular disease.Chinese Pharmacol Bull. 29:1-5. 2013.
	Jones AW, Yao Z, Vicencio JM,Karkucinska-Wieckowska A és Szabadkai G: PGC-1 family coactivatorsand cell fate: Mitochondrion: Roles in cancer, neurodegeneration, cardiovasculardisease and retrograde mitochondria-nucleus signaling.Mitochondrion. 12:86-99. 2012. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kerr JFR, Winterford CM és Harmon BV: Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer.73:2013-2026. 1994. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chan DC: Mitokondriumok: Dynamic organellesin disease, ageing and development. Cell. 125:1241-1252. 2006.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Islam MT: Oxidatív stressz és a mitokondriális diszfunkcióval összefüggő neurodegeneratív betegségek. NeurolRes. 39:73-82. 2017. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chaturvedi RK és Flint BM: Mitochondrialdiseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63:1-29. 2013.Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Laar VS, Roy N, Liu A, Raiprohat S,Arnold B, Dukes AA, Holbein CD és Berman SB: Glutamatexcitotoxicity in neurons triggers mitochondrial and endoplasmicreticulum accumulation of Parkin and in the presence of N-acetylcysteine, mitophagy. Neurobiol Dis. 74:180-193. 2015. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu L, Peritore C, Ginsberg J, Shinh J,Arun S és Donmez G: Protective role of SIRT5 against motor deficitand dopaminergic degeneration in MPTP-induced mice model ofParkinson’s disease. Behav Brain Res. 281:215-221. 2015. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Palomo GM és Manfredi G: Exploring newpathways of neurodegeneration in ALS: The role of mitochondriaquality control. Brain Res 1607. 36-46. 2015. Cikk megtekintése : Google Scholar
	Youle RJ és Strasser A: The BCL-2 proteinfamily: Ellentétes tevékenységek, amelyek a sejthalált közvetítik. Nat Rev MolCell Biol. 9:47-59. 2008. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Vercauteren K, Pasko RA, Gleyzer N, MarinoVM és Scarpulla RC: PGC-1-related coactivator: CREB/NRF-1-kötő domén azonnali korai expressziója és jellemzése, amely a citokróm c promóter elfoglalásával és a légzésnövekedéssel van kapcsolatban. Mol Cell Biol. 26:7409-7419. 2006. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Transcriptional paradigms inmammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev.88:611-638. 2008. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Betts J, Lightowlers RN és Turnbull DM: Neuropathological aspects of mitochondrial DNA disease. NeurochemRes. 29:505-511. 2004. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Tanji K, Kunimatsu T, Vu TH és Bonilla E: Neuropathological features of mitochondrial disorders. Semin CellDev Biol. 12:429-439. 2001. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Aluvila S, Mandal T, Hustedt E, Fajer P,Choe JY and Oh KJ: Organization of the mitochondrial apoptotic BAKpore: A BAK homodimerek oligomerizációja. J Biol Chem.289:2537-2551. 2014. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH,Thompson CB és Korsmeyer SJ: Bad, aBcl-XL és Bcl-2 heterodimer partnere, kiszorítja a Bax-ot és elősegíti a sejthalált. Cell.80:285-291. 1995. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hock MB és Kralli A: Transcriptionalcontrol of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol.71:177-203. 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Handschin C, Rhee J, Lin J, Tarr PT andSpieglman BM: An autoregulatory loop controls peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha expressionin muscle. Proc Natl Acad Sci USA. 100:7111-7116. 2003. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Schaeffer PJ, Wende AR, Magee CJ, NeilsonJR, Leone TC, Chen F és Kelly DP: Calcineurin andcalcium/calmodulin-dependent protein kinase activate distinctmetabolic gene regulatory programs in cardiac muscle. J Biol Chem.279:593-603. 2004. View Article : Google Scholar
	Rohas LM, St-Pierre J, Uldry M, Jäger S,Handschin S és Spiegelman BM: A cellularenergy homeostasis alapvető rendszere, amelyet a PGC-1 alfa szabályoz. Proc Natl Acad SciUSA. 104:7933-7938. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Puigserver P, Rhee J, Lin J, Wu Z, YoonJC, Zhang CY, Krauss S, Mootha VK, Lowell BB és Spiegelman BM: Az energiafelhasználás citokin stimulálása a PPARgamma koaktivátor-1 p38 MAP kináz aktiválásán keresztül. Mol Cell. 8:971-982. 2001.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

.