Aristotelész tanította Nagy Sándort (i. e. 356-323), mielőtt a fejedelem i. e. 336-ban megörökölte Macedónia trónját, és elkezdte kiterjeszteni az apja által hódítással megszerzett birodalmat. Később az athéni Líceum kertjébe olyan növények kerültek, amelyeket Alexandrosz seregeinek hívei adományoztak. Theophrastos számos növényleírását olyan utazóktól kapott beszámolókra alapozta, akik Alexandrosz birodalmának távoli vidékein jártak. Az alexandriai könyvtár, amelyet Dioszkoridész valószínűleg használt, Alexandrosz hadvezére, I. Ptolemaiosz Szoter (i. e. 367 körül – i. e. 283 körül) uralkodása alatt nyílt meg. I. Ptolemaiosz Sándor közeli személyes barátja volt, és lehet, hogy Arisztotelész által tanított diáktársa volt. Nagy Sándor halála után, i. e. 323-ban lett Egyiptom uralkodója. A könyvtár tervezésének és felügyeletének tényleges munkáját Phaleroni Démétrioszra (i. e. 350 körül – i. e. 280 körül), Theophrasztosz líceumi tanítványára bízták.

Alexandrosz i. e. 340-től régensként kormányozta Makedóniát, míg apja, II. Fülöp egy nagy makedón hadsereg élén megszállta a keletről Makedóniával határos Trákiát. Később Alexandrosz összeveszett Fülöppel, és elhagyta Makedóniát, de i. e. 336-ban Fülöpöt meggyilkolták, és a 20 éves Alexandrosz lett III. makedóniai Sándor, akit később Nagy Sándornak neveztek. Ahogy Fülöp halálának híre elterjedt, a makedónok által meghódított országokban az emberek esélyt láttak a szabadságuk visszaszerzésére, és Alexandrosznak cselekednie kellett. Először is kivégeztette minden ellenfelét Makedónián belül, majd visszaállította a makedón uralmat Görögországban, Trákiában és Illyriában.

Az i. e. 398-319 körül élt tapasztalt hadvezért, Antipatert (i. e. 398-319) hagyva a rend fenntartására otthon, i. e. 334-ben Alexandrosz nagy erőket vezetett Kis-Ázsiába, birodalmi terjeszkedésének első szakaszaként. A makedónok legyőztek egy nagy perzsa sereget, biztosították Kis-Ázsia partvidékét, majd i. e. 333-ban újabb perzsa sereggel harcoltak és győztek le, amelyet ezúttal III. Dareiosz perzsa király vezetett. Sándor seregei ezután Szírián és Fönícián keresztül dél felé harcoltak. Kr. e. 331 tavaszán a makedónok bevonultak Egyiptomba. Néhány hónap múlva visszatértek Tíruszba, ahol erősítést kaptak Európából, és kelet felé vették az irányt. A Tigris folyótól keletre fekvő Gaugemalánál ismét legyőzték a perzsákat, elfoglalták Babilont, majd elfoglalták Szúszát és a perzsa fővárost, Perszepoliszt, és Alexandert Ázsia királyává kiáltották ki. A makedónok ezután folytatták Dareiosz üldözését, akit haldokolva találtak az egyik saját nemese által ejtett sebek miatt – akit később a makedónok elfogtak, és Sándor parancsára megbüntettek. Kelet felé, Közép-Ázsiába nyomulva elérték a nyugat-kínai Tian Shan-hegységet, ahol egy görög katona szobrocskáját találták meg egy temetkezési helyen.

Előtte 326-ban Alexandrosz meghívta a mai Pakisztán északi részének törzsfőnökeit, hogy vessék alá magukat uralmának. Néhányan beleegyeztek, de mások ellenálltak a makedónoknak, és csak heves harcok után győztek, amelyekben Alexandrosz megsebesült. A makedón katonák, akik hazájuk és családjuk után vágyakoztak, ellenezték Sándor tervét, hogy tovább nyomuljon Indiába, és rábeszélték, hogy forduljon vissza. Elérték Babilont, ahol Alexandrosz i. e. 323. június 11-én halt meg II. Nebukadneccar palotájában. A történészek bizonytalanok halálának okát illetően, de a legvalószínűbb, hogy betegség okozta. Még egy hónap múlva Sándor 33 éves lett volna. Amint az alábbi térkép mutatja, birodalma csúcspontján nyugaton Makedóniától keleten az Indus-völgyig, a Fekete- és a Kaszpi-tenger déli partjaitól Egyiptomig terjedt. A birodalom Sándor halála után néhány éven belül szétesni kezdett, számos független királyságra szakadva.

Alexander Arisztotelész tanítványa volt, és bár a fiatalember tanulmányai megszakadtak, rendkívül intelligens volt, és Arisztotelész nagy hatást gyakorolt a fejlődésére. Arisztotelész minden tanítványát a természet megfigyelésére és vizsgálatára ösztönözte, és Sándor élénken érdeklődött a növények és az állatok iránt. Nagyszámú tudós kísérte őt, amikor seregeit vezette. Távolságokat mértek, térképeket készítettek, tanulmányozták az ismeretlen vallásokat, valamint a növény- és állatvilágot. Amikor ismeretlen növény- vagy állatfajokra bukkantak, Sándor mintadarabokat küldött vissza Európába, sok példányt az athéni Lyceumba, hogy maga Arisztotelész is felfigyeljen rájuk. Összegyűjtötte, amit tudott a helyi gyógynövényes kezelésekről, és gyakorolta az orvoslást, személyesen kezelve a katonáit sújtó sérülések és betegségek egy részét.

Előtte 332-ben Alexandrosz megalapította Alexandria városát Rhakotisz, egy egyiptomi halászkikötő helyén. A várost Görögország és Egyiptom kultúrájának összekötésére szánta, de az építkezés megkezdése után csak néhány hónapig maradt ott, és soha nem tért vissza. Sándor halála után I. Ptolemaiosznak sikerült elérnie, hogy holttestét a városba szállítsák. Az alexandriai könyvtár a Lyceum másolataként épült, oszlopos sétánnyal és kertekkel. Voltak előadótermek, olvasótermek és egy közös étkező, és a könyvtár a Musaeum mellett és annak szolgálatában állt, amely egy tudományos intézményként használt templom volt – és innen származik a múzeum szó is. A könyvtár vezetői azt az utasítást kapták, hogy gyűjtsék össze a világ összes információját. A könyvtár képviselői részt vettek az athéni és rodoszi könyvvásárokon, és valahányszor egy hajó megérkezett a kikötőbe, a rajta lévő könyveket lefoglalták és lemásolták, a könyvtár pedig megtartotta az eredetit, a másolatokat pedig visszaküldte a hajósnak. Ez az a könyvtár, ahol Pedanius Dioscorides tanulhatott. A könyvtár nagy része i. e. 48-ban egy polgárháború során véletlenül leégett, és bár a könyvtár egy fiókja, az úgynevezett leánykönyvtár a várostól délre továbbra is működött, i. e. 391-ben ez is elpusztult, amikor I. Theodosius római császár (347-395) elrendelte az összes pogány templom elpusztítását.