Kutatások
Tanulmányainkban egy uniós növényt, a Pisum sativumot (borsó) vizsgáltuk. A borsó a vírusok széles skálájára fogékony, beleértve a borsó enációs mozaikvírust, a borsó korai barnulás vírusát és a burgonyavírus Y csoportjába (Potyviridae) tartozó vírusok egy sorát. Ez utóbbi csoporton belül a Bean yellow mosaic virus, a Bean common mosaic virus, a Pea mosaic virus és a Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) mind fontos kórokozók. Különösen a PSbMV-t tanulmányoztuk, amelyre az összes kereskedelmi borsófajta fogékony. Ezt a fogékonyságot súlyosbítja az a tény, hogy ez a vírus nemcsak növényről növényre terjed a levéltetű vektora révén, hanem a vetőmagban vertikálisan is átadódik nemzedékről nemzedékre. Ez a tulajdonsága a borsó csíraplazma-gyűjtemények súlyos fertőzését eredményezte, és nagyon hatékony eszközt biztosít a növények korai és széles körű fertőzésére, röviddel a vetőmag csírázása után. Ha figyelembe vesszük, hogy egy mindössze 0,1%-os vetőmag-átviteli hatékonyság 10 000 fertőzést eredményezne a 107/hektáros magvetés után, akkor nyilvánvalóvá válik a vetőmag-átvitel fontossága. Jelenleg ezt a problémát a vetőmagminták betakarítás utáni hatékony vizsgálatával, a vírusköpenyfehérje immunodetektálásával és a fertőzött vetőmagtételek visszautasításával lehet kezelni. Alternatív megoldásként, és mivel a vetőmagok átvitele számos borsófajtában 0 és 100% között változik, megvizsgáltuk, hogy a vetőmagok átvitelével szembeni rezisztencia nemesíthető-e továbbfejlesztett borsóvonalakban. Az átvitelt nem mutató vagy 60-80%-os átvitelt mutató vonalak közötti tesztkeresztezésekben és visszakeresztezésekben a rezisztencia domináns tulajdonságként viselkedett, bár az F2 és BC2 generációkban nem szegregálódott mendeli tulajdonságként. A fenotípus kvantitatív jellege azt sugallta, hogy a vetőmag-átvitel nehezen illeszthető be rezisztenciajellemzőként egy hagyományos nemesítési programba.
A PSbMV-vel szembeni természetes rezisztenciát észak-afrikai és ázsiai borsófajokban azonosították, bár eddig ezeket a recesszív géneket nem vitték be kereskedelmi vonalakba. A genetikai elemzés kimutatta, hogy ezek a gének a borsó genomjának két helyén más, különböző potyavírus-specifitású recesszív génekkel klasztereződnek. Az sbm-1, sbm-3 és sbm-4 gének, amelyek a PSbMV PI, L-l és P4 patotípusával szembeni rezisztenciát biztosítják, a 6. kromoszómán találhatók, míg az L-l patotípussal szembeni rezisztenciát biztosító sbm-2 gén a 2. kromoszómán található. Bár ez a szerveződés a 2. és 6. kromoszómák közötti helyi génkonverzióra és transzlokációra utal, más bizonyítékok arra utalnak, hogy a két géncsoportnak eltérő eredete és funkciója lehet. A különböző patotípusok között létrehozott rekombináns hibrid vírusok felhasználásával a vírus avirulencia-determinánsát az sbm-1 vírus genomhoz kötött fehérjéjeként (VPg) határozták meg. Az sbm-1 gén szerkezeti és funkcionális elemzése a témája a BI04-CT97-2356 számú EK-biotechnológiai projektnek (www.dias.kvl.dk/eupsbmv), amelyben dán, finn, spanyol és brit kutatócsoportok és ipari szereplők vesznek részt.
Az sbm-1 gén jellemzése különleges szellemi és gyakorlati hasznot hoz. Mivel az összes vírusrezisztenciagén mintegy 20%-a és a potyvírusokkal szembeni rezisztenciát biztosító gének mintegy 40%-a recesszív, az sbm-1 működésének és a szomszédos sbm- és más potyvírusrezisztenciagének specifitásának megértése a betegségek széles körében fontos lesz. Az sbm- projektnek azonban technikai kihívásai is vannak, nem utolsósorban a borsó genomjának mérete és redundanciája miatt. A borsó genomja haploid genomonként körülbelül 5 x 109 bázispár, ami mintegy 50-szer nagyobb, mint az Arabidopsis thaliana genomja. A borsó génjeinek térképalapú klónozása még nem valósult meg, és nagyméretű inzertkönyvtárak még nem állnak rendelkezésre. Az sbm-1-ben azonban megvan a lehetőség a rezisztenciagének új osztályának azonosítására. A más fajokból eddig klónozott rezisztenciagének két osztályba sorolhatók. A domináns rezisztenciagének, amelyek specifikus vírusok, gombák és baktériumok ellen működnek, nagyjából az “NBS-LRR” osztályba tartoznak, és a fertőzéssel szembeni hiperszenzitív rezisztenciát közvetítik. Az egyetlen klónozott recesszív gén (mlo) az árpában a lisztharmattal szembeni nem fajspecifikus rezisztenciát közvetíti, és a kórokozónak az elhalt sejtekben való lokalizációjával is összefügg. Funkcionálisan az Mlo a konstitutív rezisztencia negatív szabályozójaként működik. Ezzel szemben az sbm-1 faj (vagy patotípus) specifikus, és nem kapcsolódik a sejthalálhoz. Ezen összehasonlítások alapján az sbm-1 több funkcionális mechanizmusa is lehetségesnek tűnik. Először is, az sbm-1-et tekinthetjük domináns érzékenységi faktornak, amely a vírus replikációjának segítéséhez szükséges. Ez illeszkedne a VPg valószínűsíthető részvételéhez a vírus RNS replikációjában és ahhoz a megfigyeléshez, hogy a rezisztens növényekből származó protoplasztok nem mutatnak kimutatható vírusreplikációt . Másodszor, az Mlo-hoz hasonlóan az Sbm-1 is a rezisztencia negatív szabályozójaként működhet, bár az mlo-tól eltérő specificitás miatt az Sbm-1 a rezisztenciagének egy külön osztályába sorolható. Harmadszor, az sbm-1 domináns, de dózisfüggő gyenge rezisztencia allél lehet. Mi az első lehetőséget részesítjük előnyben, mint a legközvetlenebb és legegyszerűbb értelmezést.
Az EK-biotechnológiai projektben szereplő komponensünk esetében úgy döntöttünk, hogy genetikai megközelítéseket használunk az sbm-1 rezisztenciagén termékének azonosítására. A megfelelő borsóvonalak azonosítása után (homozigóta rezisztencia- és fogékonysági allélokat hordozó BC4 vonalpár) cDNS-AFLP stratégiát alkalmaztunk az introgresszált régióból származó expresszált gének azonosítására. Eddig tíz polimorf cDNS-t azonosítottak. Ezeket rekombináns beltenyésztett családok segítségével térképezik fel, hogy megerősítsék genomiális eredetüket. Alternatív stratégiánk az sbm-1 géntermék “kihalászása” az élesztő-kéthibrid rendszer alkalmazásával, amelyben a PSbMV VPg a csalifehérje. Két erős jelölt cDNS-t és nyolc másik interaktorfehérjét kódoló cDNS-t azonosítottunk egy fogékony borsóvonalból készült borsó cDNS-könyvtárból. Ezeket a cDNS-eket is szekvenáljuk és térképezzük.
Egy korábbi EC-AIR projekt (# CT94-1171) részeként, amelyben dániai, franciaországi és brit tudományos és ipari partnerek vettek részt, szintén feltártuk a PSbMV elleni PDR kialakításának lehetőségét transzgenikus borsóban. Mivel más rendszerekben a vírus replikáz génjét általában a poszttranszkripciós géncsendesítés (PTGS) folyamatának beindításával használták a PDR kialakítására, a PSbMV replikáz cisztronját (NIb) használtuk a borsóban történő transzgenikus expresszióhoz. A 35S promóter -Nib – 35S terminátor konstrukciót hordozó Agrobacterium tumefaciens T-DNS-sel és a bar génnel, mint a transzformált szövetek Bialophos herbicid jelenlétében szelektálható markerével transzformált 35 borsóvonalból három vonal bizonyult rezisztensnek a PSbMV-vel szemben. E vonalak közül kettő a Nib gén 3′ végének közvetlen ismétlődését hordozta (NIbIb), mivel volt némi bizonyíték arra, hogy a komplex transzgén elrendezések nagyobb potenciállal rendelkeznek a PTGS beindítására. E vonalak mindegyike a PDR egy olyan típusát mutatta, amelyet “regenerálódásnak” nevezünk, amikor a kihívás beoltása kezdeti fertőzést eredményez, de a növények gyorsan regenerálódnak, és nem mutatnak több tünetet vagy vírusfelhalmozódást. A felépült szövetek ezután rezisztensek a homológ vagy közeli rokon vírusizolátumokkal való további fertőzéssel szemben. Hogy felmérjük ennek jelentőségét a szántóföldön, ahol a növényeket rokon vírusok populációjával támadhatják meg, megvizsgáltuk a PSbMV különböző izolátumainak PTGS kiváltására és az indukált PTGS célpontjainak képességét. Ez azt mutatta, hogy a NIb cisztronban kb. 89%-os vagy annál nagyobb azonossággal rendelkező vírusok képesek a rezisztencia kiváltására, bár a második kihívó vírus célpontnak tekintett specifitási követelményei magasabbak lehetnek. Referenciaként a két legjobban eltérő szekvenált PSbMV izolátum 89%-ban különbözik egymástól a Nib régióban. A PTGS-ben a kiváltáshoz és a célba juttatáshoz szükséges specificitási követelmények közötti különbség fontos szempont lesz a technológia kereskedelmi haszonnövényekre történő alkalmazása szempontjából. A Nib transzgenikus borsóban a PSbMV izolátumokkal szembeni viszonylag széles körű rezisztencia ellentétben áll a természetes sbm-rezisztencia gének esetében megfigyelhető szélsőséges patotípus-specifikussággal, ahol a vírus avirulencia-determinánsában csak egy vagy néhány változás elegendő ahhoz, hogy egy PSbMV izolátumot avirulensből virulenssé változtasson.
A kezdeti fertőzés rövid időtartama ellenére a transzgénikus borsónövények jó növekedést és magkészletet mutattak a kihívás beoltását követően, és üvegházi körülmények között a nem fertőzött transzgénikus vagy nem transzgénikus vonalakkal egyenértékű terméshozamot adtak. Úgy véljük, hogy a transzformált növények szelektálására szolgáló bar gén használatára vonatkozó engedélyezési megállapodások függvényében ezek a növények hasznos kiegészítői lehetnek az új, javított borsóvonalak kifejlesztéséhez felhasználható kórokozó-rezisztencia géneknek.
A transzgenikus borsónövények az első olyan hüvelyesek, amelyek PDR-t mutatnak a potyvírusokkal szemben, és a leguminosae-n belül az első kísérleti példák közé tartoznak a PTGS-t mutató növényekre. Ezért értékes volt annak megállapítása, hogy a PTGS-t és a rezisztenciát szabályozó elvek ebben a rendszerben alátámasztják a gyakrabban használt kísérleti növényekkel (pl. Nicotiana spp.) jellemzett elveket. Amint az a PTGS esetében várható volt, az indukált vírusrezisztencia a transzgén RNS és a PSbMV RNS lebomlásához kapcsolódott. Azt is kimutattuk, hogy a PTGS-t ezekben a növényekben egy szisztémás jel közvetítette, amely a vírusfertőzés kezdeti fázisában keletkezett, és hogy ez a jel képes volt közvetíteni a PTGS terjedését az NIb transzgén átírt régiójának metilációjának indukálásával .
Végeredményben felismertük, hogy a mezőgazdasági ipar számára előnyös lenne a borsóban a PSbMV-vel szembeni stabil és hatékony rezisztencia. Ennek eléréséhez a legkevésbé vitatható út a természetben előforduló rezisztenciák beépítése lenne (akár a vetőmagok átvitelével, akár a vírus szaporodásával szemben) a hagyományos nemesítési stratégiák alkalmazásával. A PSbMV vetőmag-átvitel genetikai összetettségének viszonylag gyenge megértése azt jelenti, hogy ez rövid távon valószínűleg nem lesz hasznos. Az sbm- gének ígéretesebbek, bár a szorosan kapcsolódó genetikai markerek hiánya és a rezisztencia recesszív jellege okoz némi nehézséget. Alternatív megoldásként bebizonyítottuk a transzgenikus technológia alkalmazásával történő rezisztencia létrehozásának lehetőségét, bár a biológiai biztonság és a közvélemény elfogadottságának kérdéseivel még foglalkozni kell. Ezeken az alkalmazott megfontolásokon túlmenően a kutatás olyan anyagokat és ismereteket hozott és hoz létre, amelyek befolyásolni fogják, hogy a kapcsolódó megközelítéseket hogyan lehet más kultúrnövényeknél alkalmazni. Különösen fontos lesz a vírusrezisztenciagének egy új osztályának hatásmechanizmusának megértése.