Discussion
A jelen tanulmány a kollaterális EC-k és SMC-k számos olyan sajátos jellemzőjét azonosította, amelyek a kollaterális erek bevezetőben vázolt egyedi jellemzőinek hátterében állhatnak vagy hozzájárulhatnak azokhoz. Azt találtuk, hogy az alacsony és oszcilláló nyírófeszültség ellenére, amely a kollaterálisokban alaphelyzetben, elzáródás hiányában jelen van, EC-ik ugyanolyan mértékben igazodnak az ér tengelyéhez, mint amilyen mértékben jelen vannak a legdisztálisabb arteriolákban és a leszálló aorta-erek nagy sebességű ortográd lamináris áramlásában. Mind a kollaterálisok, mind az arteriolák endotélsejtjei rendelkeznek primer csillókkal, a kollaterálisok pedig kevesebbel. A kollaterálisok simaizomsejtjei folyamatosak, ellentétben a DMA-kkal. A kollaterálisokban a DMA-khoz képest magasabb a pro- és anti-inflammatorikus, valamint a pro- és anti-proliferációs útvonalakhoz kapcsolódó gének expressziójának szintje. A kollaterális falsejtek magasabb sejtproliferációs rátáját alátámasztja az a megfigyelés, hogy a kollaterálisok röviddel a kialakulásuk után elkezdenek kanyargósodni az embrióban, ami a középső életkorig (16 hónap, 49 emberi év-egyenérték ) növekszik. A fenti eredmények betekintést nyújtanak a strukturális és molekuláris specializációkba, amelyek a kollaterális erek egyedi jellemzőinek és funkcióinak hátterében állhatnak.
A véráramlás konvergenciája a kollaterálisokban alaphelyzetben alacsony és “zavart” áramlási/nyírófeszültségi erőket gyakorol a muralsejtjeikre, azaz vagy nincs áramlás, vagy nagyon alacsony áramlás, amely ide-oda oszcillál (~1-10 alkalommal percenként) és átlagosan nulla . Ez a Bernoulli-összefüggésnek megfelelően megnövekedett falfeszültséget eredményez. Ha az artériás keringés máshol is jelen van, pl. a bifurkációkban, az aorta belső ívénél vagy a plakkoktól lefelé, az alacsony és zavart nyírófeszültség kedvez az el nem igazított, macskaköves EK morfológiának, amely fokozott oxidatív stresszel, gyulladással, az öregedés markereivel és alacsony eNOS/NO aktivitással (azaz endothelialis diszfunkcióval) jár együtt . Meglepő módon azonban azt találtuk, hogy a kollaterális EC-k ugyanolyan igazodással (és sejtméretekkel) rendelkeznek, mint a DMA-kban és a leszálló aortában lévő EC-k. Nem vizsgáltuk, hogyan specifikálódik ez a gyulladáscsökkentő szerkezeti fenotípus. Lehetséges, hogy az általunk azonosított egyéb egyedi jellemzők közül egy vagy több is szerepet játszik (lásd alább). Másrészt a 2. ábrán az áramlásra és a nyírófeszültségre vonatkozó adatokat altatott állatokban kaptuk. Az éber viselkedés során a kollaterálisoknak lehetnek olyan időszakai, amikor az egyik vagy a másik irányban tartós áramlás tapasztalható, amelyet az általuk keresztezett artériás fák által ellátott terület regionális metabolikus aktivitásának változásai idéznek elő. Nem ismert, hogy a kollaterálisok ily módon hozzájárulnak-e a véráramlás és az oxigénszállítás fiziológiás metabolikus szabályozásához, azaz az agyban a neurovaszkuláris csatoláshoz és máshol a funkcionális hiperémiához. A tartósan egyirányú áramlás ilyen időszakai azonban elősegíthetik az általunk megfigyelt EK-orientációt. A kiváltó okra való tekintet nélkül feltételezzük, hogy a kollaterális EC-k igazított fenotípusa a kollaterálisok fenntartását elősegítő és ritkulásukat mérséklő védőmechanizmusok egy csoportjának része (vagy markere) (9. ábra).
Tudomásunk szerint ez az első jelentés, amely kimutatja, hogy a kollaterálisokat és az arteriolákat bélelő EC-k elsődleges csillókkal rendelkeznek. Ezek sokkal nagyobb mennyiségben fordulnak elő, mint amiről korábban egészséges egyénekből származó vezetékes erek esetében beszámoltak (azaz hiányoznak vagy az EC-k kevesebb mint 1%-án vannak jelen ): a kollaterális EC-k 18%-a rendelkezik PrC-vel, szemben a DMA-k 28%-ával. Haust 1984-ben írta le az EC-ken lévő primer csillókat nyulak és emberek érelmeszesedésben szenvedő aortájában. Későbbi jelentések csillós EC-ket írtak le egy 20 hetes emberi magzat tobozmirigyének kapillárisaiban , fejlődő szív- és aortabillentyűkben , és az ottani hivatkozások], aterómák körül, ektopikusan ApoE-/- egerek közös nyaki verőerében, valamint egészséges egyénekben a vezetékes artériák bifurkációinál és az aortaív belső görbületénél; ezzel szemben a csillók hiányoznak vagy csaknem hiányoznak az artériák azon régióiban, ahol a nyírófeszültség lamináris . A legtöbb más sejttípus kifejezi a PrC-t a fejlődés során, bizonyos sejttenyésztési körülmények között és felnőttekben . Sejttípustól függően a PrC részt vesz az embrionális aszimmetria specifikációjában, a centriolák elrendeződésében, a proliferáció/sejtciklus szabályozásában, az autofágiában, az áramlást érzékelő mechanotranszdukcióban, a kemocepcióban, valamint a jelzőfehérjék kompartmentalizációjában és a cilioplazma, a citoplazma és a nukleoplazma közötti kereskedelemben (pl. a Gli és a PDGFRα esetében) . Ha jelen vannak, a csillók a nem proliferáló sejtekben vannak a legnagyobb mennyiségben jelen, a proximális végük a plazmalemma invaginációjában (csillók zsebében) rögzül az EC-kben és más, de nem minden sejttípusban . A primer csillók a bazális test anyacentrióljával komplex módon kapcsolódnak a mikrotubulus-szervező központhoz (MTOC) . A cilium szétszerelése/visszaszerelése az S-fázisban és a centriol felszabadulása elengedhetetlen a sejtosztódáshoz . Mivel a PrC a MTOC-on keresztül kapcsolódik a citoszkeletonhoz, az EC-kben az áramlás által kiváltott ciliáris hajlítás az egész sejtben továbbítható, beleértve a sejt-sejt és sejt-mátrix kapcsolódási pontokat is . A primer csillók a folyadék nyírási stresszt a vese tubuláris epitélsejtekben és az EC-kben egy olyan útvonalon keresztül továbbítják, amely kivételesen érzékeny a nyírási stresszre, és amelyben a Pkd1 és Pkd2 által kódolt policisztin-1 és policisztin-2 vesz részt . A policisztin-1 mechanoszenzitív tulajdonságokkal rendelkezik, míg a policisztin-2 egy TRP kalciumcsatorna. Mindkét fehérje szükséges a nyírási stressz érzékeléséhez és a nitrogén-oxid felszabadításához . A PrC hibái számos rendellenességgel járnak együtt. Például a PKD1 és PKD2 mutációi okozzák az autoszomális domináns policisztás vesebetegséget, a betegek vese EC-je és tubuláris sejtjei hiányos kalcium- és NO-válaszokat és fokozott proliferációt mutatnak .
A primer csillók hiányoznak a humán köldökvéna EC-kből, amelyeket lamináris nyírási stressz és proliferatív nyugalmi állapot mellett tartanak fenn sejtkultúrában. A humán köldökvénákban az EC-k kevesebb mint egy százalékának vannak a lumenbe nyúló csillók, míg egy nagyobb frakcióban a csillók intracellulárisan helyezkednek el . Az embrionális aorta és a belőle tenyésztett EC-k egyetlen ciliummal rendelkeznek, amely a lumenbe nyúlik . Az endothelialis csillók az embrionális fejlődés során a magas nyíróstresszű régiókban vannak jelen, a nyíróstressz-érzékeny KLF2 transzkripciós faktor expressziójával együtt, amely transzaktiválja az eNOS-t és más gyulladáscsökkentő és antiproliferatív géneket . Az alacsony vagy zavart nyírófeszültségű régiókban a PrC szétesik/hiányzik, és a Klf2 és az eNOS expressziója megszűnik, illetve csökken . A Klf2 expressziója szintén gátolt az embrionális artériákból izolált nem-ciliált EC-kben, és a PrC kémiai eltávolítása a kultúrában lévő EC-kből hasonló hatást fejt ki, azaz megszünteti a Klf2 expressziót . Érdekes módon a felnőtt ApoE-/- egerek EC-jeiben, amelyek endotheldiszfunkcióval rendelkeznek, de nem alakulnak ki plakkok, a csillók ektopikusan expresszálódnak a közös nyaki verőérben a lamináris áramlás jelenléte ellenére, összehasonlítva a vad típusú egerekkel, amelyeknek nincsenek csillói . A csillók elvesztek, amikor nagy nyírófeszültséget idéztek elő egy áramláskorlátozó gipsz beültetésével az ér köré. A közös karotiszok gipszbeöntése vad típusú egerekben csak az alacsony és zavart nyírófeszültségű régiókban indukált ciliogenezist. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PrC kifejeződése az EC-ken in vivo felnőtteknél az alacsony/zavart nyírófeszültségű régiókra korlátozódik, de lamináris áramlású artériákban ektopikusan is előfordulhat a hiperlipidémia és valószínűleg más érrendszeri kockázati tényezők által okozott endotheldiszfunkció jelenlétében. Megjegyzendő, hogy az erősen csillós, zavart áramlású területeken, mint például az aortaív belső görbülete vagy a plakkok után, az EC-k körülbelül 25%-a rendelkezik egyetlen csillóval, míg a többi hiányzik , ez az arány hasonló ahhoz, amit az arteriolákban és a kollaterálisokban megfigyeltünk.
Eredményeink, miszerint a PrC egészséges fiatal felnőtt egerekben is jelen van az arteriolákon és a kollaterálisokon, rávilágítanak arra, hogy szükség van olyan vizsgálatokra, amelyek a csillók működését vizsgálják ezekben az értípusokban. Ez magában foglalja annak meghatározását, hogy a kollaterális EC-ken az arteriolákhoz képest kevesebb csillóról tett megfigyelésünknek van-e funkcionális jelentősége. Az endothelsejtek mechanikusan, elektromosan és diffúziósan kapcsolódnak a szomszédos EC-khez és SMC-khez , így az EC-knek csak egy töredékének kell csillókat kifejeznie a mechano-érzékeny vagy más jelek továbbításához. A nagy nyírófeszültség a tenyésztett EC-kben a csillók szétszerelését okozza, míg az oszcilláló áramlás megfordítása a csillók kifejeződését indukálja. Feltételezzük, hogy az arteriolákon és a kollaterális EC-ken lévő csillók tükrözhetik az arteriolákban az alacsonyabb áramlás/nyírófeszültséget, a kollaterálisokban pedig a nagyon alacsony és zavart áramlást, és hogy a kollaterális EC-ken lévő kevesebb PrC azt szolgálhatja, hogy csökkentse érzékenységüket az uralkodó zavart nyírófeszültségi környezetre. Más szóval, a kollaterális EC-ken lévő kevesebb csilló része lehet egy olyan adaptációs repertoárnak, amely a KLF2/4, az eNOS és más gyulladáscsökkentő/antiproliferatív faktorok fenntartott vagy fokozott expressziója révén ellensúlyozza vagy ellenzi az alacsony fokú gyulladásos, oxidatív, proliferatív és apoptotikus jeleket, amelyeket a kollaterálisokban jelen lévő zavart hemodinamikai környezet elősegít (9. ábra). Egorova és munkatársai valami hasonlót javasoltak, azaz, hogy mivel a PrC jelenléte az EC-ken a KLF2 expressziójával jár együtt, az endothelialis csillók féket jelezhetnek az EC-aktivációnak az alacsony és zavart áramlású régiókban. A csillók védő szerepét ezekben a régiókban alátámasztja az a közelmúltbeli jelentés, hogy az endotél csillók eltávolítása az Ift88 feltételes deléciójával növelte az ateroszklerózist és a gyulladásos gének expresszióját, és csökkentette az eNOS aktivitását Apoe-/- egerekben, amelyeket magas zsírtartalmú étrenddel etettek , és hogy az endotél érzékennyé válik az atero-érzékeny régiókban az osteogén differenciálódásra Tg737 (orpk/orpk) cilium-defektív egerekben . Az is lehetséges, hogy ha a PrC védő hatású, akkor a kollaterálisokban lévő kevesebb PrC hozzájárulhat ezen erek nagyfokú érzékenységéhez az öregedésből és más érrendszeri kockázati tényezőkből eredő ritkulással szemben. A kollaterálisokon lévő kevesebb csilló azonban egyszerűen másodlagos vagy járulékos hatást tükrözhet, ami például a kollaterális EC-k magasabb eredendő proliferációs rátájának következménye, amint azt a kollaterális tortuozitás progresszív növekedése bizonyítja (lásd alább), mivel a PrC jelenléte és a bazális testtel való társulásuk feltehetően elősegíti a sejtek eltávolítását a sejtciklusból . Jövőbeni vizsgálatokra lesz szükség annak meghatározására, hogy az EC-ken található többszörös csillókra vonatkozó megállapításunk tükrözi-e a proliferatív szeneszcencián átesett EC-ket és a kapcsolódó sikertelen citokinézist és nukleáris poliploidiát .
A közelmúltban kimutatták, hogy az EC-k a fejlődő egér retinában a PrC-re támaszkodnak az érkapcsolatok stabilizálása érdekében az érplexus átalakítása során az alacsony vagy közepes nyírófeszültségű régiókban . Az endothelialis csillók érzékelik az áramlást zebrafish embriókban, részt vesznek a mural sejtek toborzásában az artériás fated erekbe, és szükségesek a normális érmorfogenezishez . A kollaterálisok száma és átmérője a középkorban kezdődően csökken . Ezt az életkor okozta ritkulást erősen felgyorsítja a genetikai vagy farmakológiai indukált eNOS/NO-hiány vagy az érrendszeri rizikófaktorok jelenléte . A megnövekedett nyírófeszültség kiváltja a kollaterálisok kifelé irányuló átalakulását akut vagy lassan kialakuló artériás elzáródást követően . A Pkd1+/- egerek és az autoszomális domináns policisztás vesebetegségben szenvedő betegek endothelialis eNOS/NO diszfunkcióval rendelkeznek . Fontos lesz a jövőbeni vizsgálatokban megvizsgálni, hogy a kollaterális PrC részt vesz-e a fenti funkciók közül egy vagy több funkcióban a policisztin-1 EC-specifikus knockdownja segítségével, mivel : 1) hiánya a ciliáris funkció megváltozásához vezet, 2) a policisztin-1 a policisztin-2-vel együtt részt vesz a PrC áramlásérzékelésében, 3) bármelyik fehérje mutáns formája policisztás vesebetegséget okoz, 4) bizonyíték van arra, hogy a VHL, függetlenül a Hif1α lebontásában betöltött szerepétől, a GSK3β-val együtt szükséges a cilium szerkezeti fenntartásához , és 5) a Rabep2 fehérje, amely a kollaterogenezishez szükséges , a GSK3β új szubsztrátja, a cilium-bázisterem komplexben lokalizálódik, és leütése hibás ciliogenezishez vezet . A csillók jelenlétének és működésének befolyásolására szolgáló egyéb megközelítéseket, például más csillófehérjék, például a Pkd2 és az Ift88 kiütésével, szintén meg kell vizsgálni.
A disztális arteriolákkal ellentétben, amelyekben a különböző szövetekben, beleértve a retinát is, ritkás és diszkontinuus SMC-k vannak (nem tudtunk agyban végzett vizsgálatokat azonosítani) , az SMC-k folyamatosak voltak a kollaterálisokon. Feltételezésünk szerint ez a falvastagság adaptív növekedése lehet, hogy ellensúlyozza az áramlás kinetikus energiájának megnövekedett potenciális energiává (transzmurális nyomás) történő, Bernoulli által meghatározott átalakítása által okozott, a kollaterálisokban az áramlás-konvergencia következtében megnövekedett kerületi falfeszültséget. Érdekes lenne megvizsgálni, hogy az extracelluláris mátrix összetétele és mennyisége, amely segítheti az SMC-ket a kollaterálisokban megnövekedett falfeszültség kiegyensúlyozásában, különbözik-e a kollaterálisokban és az arteriolákban. Megjegyzendő, hogy a kollaterálisok a megnövekedett SMC-lefedettségük ellenére inkább kevesebb, mint több tónussal rendelkeznek a hasonló méretű arteriolákhoz képest, és hiányzik belőlük a myogén válaszkészség – a kollaterális erek további egyedi jellemzői .
A zavart hemodinamikai, prooxidatív környezet, amelyben a kollaterális falsejtek tartózkodnak, arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk, hogy a gyulladásban, sejtproliferációban, öregedésben és angiogenezisben részt vevő gének expressziója különbözik-e a kollaterálisok és a disztális arteriolák esetében. A kollaterálisok a pro-inflammatorikus, pro-apoptózis inflammaszóma gén, a Pycard, a pro-proliferatív gének, a Ki67, Pdgfb és Angpt2, az anti-proliferatív gén, a Dll4 és a differenciált artériás típusú EK marker gén, az Ephrinb2 megnövekedett mRNS-szintjét mutatták. A sejtciklus-gátló gének, a p21, p27 és p53 expressziója azonban nem különbözött, ahogyan más, a proliferációval, a sejtciklus megállásával és az öregedéssel összefüggő géneké sem (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomeráz). Nem volt különbség az EC és/vagy SMC proliferációval kapcsolatos más gének (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) és olyan gének expressziójában sem, amelyek (az első három gén esetében) szükségesek a fejlődés során a kollaterálisok kialakulásához, vagy részt vesznek az EC és SMC differenciálódásának és nyugalmi állapotának meghatározásában (Tgfb, Angpt1). A fenti proproliferációs gének fokozott expressziója a kollaterálisokban összhangban van a tortuozitás méréseinkkel, amelyek arra utalnak, hogy a kollaterális muralsejtek más artériás erekhez képest magasabb proliferációs rátával rendelkeznek: a kollaterális tortuozitás már a születést követő első napon nyilvánvaló volt, a középkorig tovább nőtt, majd csökkent. Ez utóbbi akkor következett be, amikor a kollaterálisok száma és átmérője az előrehaladott öregedéssel együtt csökken . Ezek az eredmények alátámasztják azt a hipotézist, hogy az életkorral összefüggő kollaterális ritkulást a kollaterális EC-k és SMC-k proliferatív szeneszcenciája és ezt követő apoptózisa okozza, ami a proliferációs ráta élethosszig tartó emelkedésének köszönhető, amelyet a zavart hemodinamikai és alacsony vér oxigéntartalmú környezet okoz, amelyben a kollaterálisok tartózkodnak (9. ábra).
A kollaterálisok az eNOS fokozott aktivitását is mutatták, amely korábbi vizsgálatok szerint az öregedés és más érrendszeri kockázati tényezők által okozott kollaterálisok ritkulásával szemben áll . eNOS-ból származó NO gátolja az oxidatív stresszt, a gyulladást, a proliferációt, a leukocita adhéziót, a trombocita aggregációt és a sejtek öregedését, és elősegíti az SMC relaxációját . Mivel a nyíróstressz az eNOS-eredetű NO proximális stimulusa, a kollaterálisokban az alacsony és zavart nyíróstressz-környezetben lévő megnövekedett eNOS/NO csökkentheti a kollaterális ritkulást elősegítő tényezők hatását (9. ábra). Hasonlóképpen, az EC nyírási stresszre érzékeny transzkripciós faktorok, a Klf2 és Klf4 fenntartott expressziója a kollaterálisokban az alacsony és oszcilláló áramlás ellenére, ami gátolja e faktorok expresszióját máshol az artériás érrendszerben zavart áramlás mellett , további “kiegyensúlyozó” tényezőként vagy kollaterális specializációként működhet, a megnövekedett eNOS, az összehangolt EC-k, a kevesebb csilló, a robusztus SMC-borítás és a megnövekedett ephrin-B2 és Dll4 mellett. A KLF2 és KLF4 expressziója, amelyek negatívan szabályozzák a proliferációt, a gyulladást és az angiogenezist, felszabályozzák az eNOS-t, és az alacsony és zavart nyírófeszültségű helyeken élesen lefelé szabályozódnak, nem különbözött a kollaterálisokban és a DMA-kban. Érdekes módon a PrC elősegíti a Klf2, Klf4 és eNOS expresszióját .
A fenti vizsgálatok korlátja, hogy az RNS-t boncolt erekből nyerték, amelyek EC-kből, SMC-kből és – bár kevésbé – pericitákból, fibroblasztokból és rezidens myeloid sejtekből állnak. Olyan vizsgálatokra van szükség, amelyek a sejttípusok elkülönítését és a gének szélesebb körének és a hozzájuk tartozó fehérjeszinteknek a vizsgálatát alkalmazzák. Azonban a kollaterálisok és a disztális arteriolák szükséges számú kézzel történő feldarabolásának nehézsége, a sejtdiszszociációs technikák hatása az RNS és a fehérjék alapszintjére, a “kollaterális” EC-k és SMC-k sejtkultúrás modelljeinek hiánya, valamint az, hogy egyelőre nincs kollaterális-specifikus markergén, kizárja e megközelítések alkalmazását. Megjegyzendő azonban, hogy a vizsgált gének közül többnek az expressziója specifikus vagy az EC-kre feldúsult, pl. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 és Klf4. A géntranszkripció elemzése azonban nem mindig tükrözi a fehérjeszint vagy a funkció változásait; így az oxidatív stressz, a gyulladásos, a proliferációs vagy az öregedési markerek fehérjeszinten történő vizsgálata jobban tükrözheti a sejtjellemzők különbségeit.