Abstract
Background. L’amiloidosi è una precipitazione extracellulare di materiale ialino eosinofilo di auto-origine con particolari caratteristiche di colorazione e ultrastruttura fibrillare. L’amiloidosi maculare è limitata alla pelle e diversi fattori sono stati proposti per la sua patogenesi. Il rilevamento del DNA del virus di Epstein-Barr (EBV) in questa lesione suggerisce che questo virus può avere un ruolo nella patogenesi di questa malattia. Obiettivo. Il rilevamento del DNA dell’EBV è stato fatto su 30 campioni di pelle con una diagnosi di amiloidosi maculare e 31 campioni di pelle sana nel margine di nevi melanocitici rimossi usando la PCR. Risultati. Nei pazienti positivi per il gene della beta-globina nella PCR, il gene BLLF1 del virus EBV era positivo in 23 pazienti (8 pazienti nel caso e 15 pazienti nel gruppo di controllo). Non vi era alcuna differenza significativa nella presenza di EBV DNA tra i gruppi di amiloidosi maculare (3,8%) e di controllo (23,8%). Conclusioni. I risultati di questo studio hanno dimostrato che EBV non è coinvolto nella patogenesi dell’amiloidosi maculare.
1. Introduzione
L’amiloidosi è la deposizione extracellulare di un gruppo di proteine fibrose. Esiste una varietà di approcci per la classificazione delle amiloidosi, ma il metodo più semplice è la divisione in tipi sistemici e organo-specifici (localizzati). La pelle è un tessuto coinvolto in entrambi i tipi. L’amiloidosi cutanea localizzata è di due tipi: (i) cheratinica, che può essere primaria o secondaria, e (ii) nodulare. Il tipo secondario è secondario ad altre lesioni cutanee come i tumori della pelle, i disturbi infiammatori della pelle e la fototerapia. Sono stati identificati due tipi di amiloidosi cheratotica: l’amiloidosi maculare e lichenica, e quest’ultima è più comune. Nell’amiloidosi cheratotica, i depositi di cheratina originati dal cheratinocita basale sono principalmente CK5 positivi. Il tipo cheratotico si osserva soprattutto nel sud-est asiatico, in Sud America e in Cina. Ha forme familiari (10%) e sporadiche, e quest’ultima è più comune nelle donne. I siti più comuni di coinvolgimento sono la parte superiore della schiena (area interscapolare) e le estremità (stinchi e braccia), anche se sono state descritte anche su viso, tronco e cosce. Le lesioni da amiloidosi maculare di solito appaiono sotto forma di macchie iperpigmentate con margini indefiniti composti da macule grigio-marroni, spesso con un aspetto reticolato o increspato (Figura 1). Il prurito è un sintomo comune prima dell’insorgenza dell’amiloidosi.
La patogenesi di questo disturbo non è completamente chiarita, tranne per il fatto che la cheratina depositata deriva dai cheratinociti. Sono stati proposti due meccanismi patogenetici tra cui la teoria apoptotica (fibrillare) e la teoria secretoria. Secondo la teoria apoptotica, la degenerazione dei cheratinociti danneggiati nello strato basale è seguita dalla conversione di questi corpi colloidi da parte degli istiociti dermici e dei fibroblasti in amiloide nel derma papillare (Figura 2). Secondo la teoria secretoria, i depositi di amiloide derivati dai cheratinociti basali degenerati si diffondono nel derma papillare attraverso la lamina densa danneggiata. Ci sono diversi fattori eziologici implicati nella patogenesi dell’amiloidosi maculare: fattori razziali, predisposizione genetica, fattori ambientali, sesso (femminile), ormoni femminili, esposizione alla luce solare, attrito (abrasione a lungo termine), atopia, autoimmunità (in base all’associazione con lupus eritematoso sistemico, dermatomiosite, sclerosi sistemica, sarcoidosi e nefropatia IgA) e infezione da EBV. L’EBV, la cui presenza è stata riportata nell’epidermide dell’amiloidosi maculare, è probabile che agisca come un fattore che contribuisce alla degenerazione dei cheratinociti.
Il ruolo dell’EBV nell’eziopatogenesi dell’amiloidosi cutanea primaria è stato valutato solo in due studi precedenti tra cui un singolo case report e una serie di casi di 27 pazienti dalla Cina. Considerando la carenza di studi sull’associazione tra EBV e amiloidosi maculare, ci siamo proposti di eseguire uno studio a questo proposito in Iran. Forse gli agenti antivirali possono essere utilizzati in futuro per il trattamento di questa malattia in caso di associazione con EBV.
2. Materiali e metodi
In questo studio caso-controllo, 38 campioni di amiloidosi maculare e 38 campioni di pelle sana intorno a nevi melanocitici escissi da pazienti di età e sesso compatibili senza amiloidosi maculare sono stati arruolati nell’esame clinico basato su un campionamento non casuale orientato agli obiettivi. I criteri di inclusione includevano blocchi di paraffina con tessuto sufficiente negli archivi del Dipartimento di Patologia dell’Imam Reza Hospital di Mashhad con diagnosi di amiloidosi maculare in base al rapporto patologico e alla presentazione clinica. I criteri di esclusione includevano blocchi con dati imperfetti negli archivi e campioni insufficienti per la PCR.
Nel gruppo dei casi, la deposizione di amiloide è stata confermata dalla microscopia ottica e dalla colorazione rosso Congo. Nella fase successiva, sei sezioni da 5 μm sono state preparate da ciascuno dei blocchi nei gruppi di caso e di controllo in condizioni sterili usando una lama sterile e sono state poste in provette Eppendorf sterili.
2.1. Deparaffinizzazione
Xylol/etanolo è stato usato per deparaffinizzare i tessuti paraffinati. Un mL di xilolo è stato aggiunto alle microtubi contenenti sezioni di tessuto e incubate a temperatura ambiente per mezz’ora con agitazione costante. Nella fase successiva, le microprovette sono state centrifugate a 13.000 rpm per 10 minuti, e il loro surnatante è stato scartato. Questi due passaggi sono stati ripetuti una volta. Cinquecento μL di etanolo al 100% è stato aggiunto al precipitato e centrifugato per 10 m in 13.000 rpm dopo diverse inversioni di microprovetta, e il surnatante è stato poi rimosso. Questo passaggio è stato ripetuto di nuovo. Infine, il precipitato risultante è stato posto a temperatura ambiente per far evaporare completamente l’etanolo ma non il precipitato.
2.2. Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA è stata fatta usando il kit BIO BASIC INC (Canada) con il numero di lotto 8401-140116. Per l’estrazione è stato utilizzato il tampone di lisi-T. Nella fase successiva, 100 μL di tampone di estrazione e 10 μL di proteinasi K sono stati aggiunti ad ogni microprovetta e sono stati mescolati. I campioni di tessuto sono stati aggiunti alla miscela e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Poi, i campioni sono stati incubati a 95°C per 3 minuti per inattivare la proteinasi K. Cento μL di tampone universale NST sono stati aggiunti alle provette e invertiti 10 volte. La miscela ottenuta è stata usata per la PCR.
2.3. PCR
In questo studio, la PCR è stata utilizzata per rilevare la presenza del genoma EBV nell’amiloidosi maculare. Dopo l’estrazione del DNA da blocchi paraffinati, la qualità del DNA estratto dai tessuti inclusi nella paraffina è stata determinata utilizzando i primer del gene della beta-globina. I primer del gene della beta-globina GH20 e PC04 utilizzati in questo studio hanno amplificato un frammento di 260 bp. La sequenza di questi primer era la seguente: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.I campioni che hanno prodotto il frammento di 260 bp usando i primer desiderati sono stati considerati favorevoli all’amplificazione del gene BLLF1 del virus EBV.
La presenza della sequenza EBV nei campioni di DNA estratti è stata testata usando il kit Cinna Gen con il numero di lotto 935701 (Sina Clon, Iran). Questo kit è stato progettato per determinare la qualità del DNA di EBV nei campioni infetti usando la PCR. La PCR 1x ottimizzata come miscela di Taq DNA polimerasi ricombinante, tampone PCR, MgCl2, dNTP e primer è stato il reagente utilizzato per la miscelazione. La regione altamente specifica e ripetitiva del gene BLLF1 che codifica gp 350/220 è stata amplificata dai primer. Essi possono rilevare almeno 30 copie di EBV. La presenza di frammenti di 239 bp o 256 bp indica un risultato positivo del test.
L’analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software SPSS 11.5. I grafici e le tabelle statistiche sono stati utilizzati per descrivere i dati e i test Chi-quadro e indipendenti sono stati utilizzati per confrontare l’EBV nei campioni sani e in quelli dei pazienti. In tutti i test è stato considerato il livello di significatività di 0,05.
3. Risultati
Il 50% dei pazienti erano maschi (19/38) e il 50% erano femmine (19/38). Tre pazienti erano nel gruppo di età sotto i 20 anni (7,9%), 5 pazienti 20-30 anni (13,2%), 10 pazienti 30-40 anni (26,3%), 13 pazienti 40-50 anni (34,2%), 4 pazienti 50-60 anni (10,5%), e 3 pazienti oltre i 60 anni (7,9%). L’età minima e massima erano 19 e 76 anni, rispettivamente. Ci sono stati 27 casi di infezione nel tronco (71,1%) e 11 casi nelle estremità (28,9%). Il gruppo di studio e il gruppo di controllo sono stati abbinati per età () e sesso ().
PCR è stato condotto per il gene beta-globina in 76 campioni (38 casi e 38 controlli), che era positivo in 61 campioni (30 campioni nel gruppo caso e 31 nel gruppo di controllo) ed era negativo in 15 campioni (8 campioni nel caso e 7 nel gruppo di controllo) (Figura 3).
Nei 61 campioni positivi al gene beta-globina nella PCR, il gene BLLF1 dell’EBV era positivo in 23 casi (8 casi nel gruppo di studio e 15 casi nel gruppo di controllo) ed era negativo in 38 casi (22 casi nel gruppo di studio e 16 casi nel gruppo di controllo) (Figura 4).
La PCR del gene BLLF1 di EBV era positiva al 26,7% nel gruppo di studio e al 48,4% nel gruppo di controllo. I risultati del test Chi-quadrato non hanno mostrato alcuna correlazione tra EBV e amiloidosi maculare (Tabella 1).
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4. Discussione
L’amiloidosi è nota come deposizione extracellulare di materiale ialino eosinofilo di origine propria con specifiche caratteristiche di colorazione e ultrastrutturali. Questo disturbo può verificarsi sullo sfondo di malattie sistemiche o può essere limitato alla pelle. L’amiloidosi maculare è limitata alla pelle. L’EBV può stimolare la secrezione di materiale amiloide da parte dei cheratinociti o può essere uno stimolo per la degenerazione dei cheratinociti e la conversione dei filamenti degenerati dei cheratinociti in amiloide. Studi recenti hanno indicato il ruolo delle cellule epiteliali nella riproduzione continua di EBV. I recettori della superficie cellulare di EBV trovati nell’epitelio squamoso meno differenziato suggeriscono l’infezione diretta dei cheratinociti epidermici. L’infezione può avvenire negli strati germinativi; tuttavia, la replicazione del virus è possibile solo attraverso la maturazione e la differenziazione delle cellule. L’espressione della citocheratina nei cheratinociti umani viene modificata in vitro dopo l’infezione con EBV, con conseguente conversione in fibroblasti. I fibroblasti possono fagocitare gli aggregati di cheratina e convertirli in amiloide.
Drago et al. hanno mostrato questa correlazione in Italia nel 1996. Il loro paziente era una donna di 30 anni con una storia decennale di papule e macule marroni pruriginose sul petto e sulla schiena con sintomi di sindrome da fatica cronica. Hanno potuto mostrare il genoma di EBV nelle lesioni epidermiche usando la tecnica di ibridazione in situ. Il genoma di EBV è stato mostrato principalmente nelle cellule epidermiche basali e nelle cellule dello strato superiore, specialmente nel citoplasma. Anche i test sierologici per l’EBV erano positivi nel paziente. La terapia antivirale con aciclovir e interferone alfa ha migliorato le lesioni cutanee e i sintomi generali del paziente. Un altro studio è stato condotto da Chang et al. sul tessuto cutaneo di 27 pazienti con una diagnosi di lichen e amiloidosi maculare a Taiwan nel 1997. Il metodo di ibridazione in situ ha indicato EBV DNA nelle lesioni di 11 pazienti (40,7%), mentre il gruppo di controllo (compresi tre pazienti con amiloidosi cutanea secondaria, due pazienti con amiloidosi sistemica primaria, e quattro pazienti con lichen simplex cronico) mancava di EBV DNA .
Secondo questo studio, non vi era alcuna correlazione tra EBV e amiloidosi maculare (). EBV DNA era presente in 8 pazienti con amiloidosi maculare e 15 controlli nel nostro studio. La differenza nel tasso di rilevamento di EBV DNA tra i pazienti con amiloidosi maculare e i controlli in questo studio con gli studi menzionati può essere dovuta alle seguenti ragioni:(1)Mancanza di associazione tra amiloidosi maculare e infezione da EBV: ci sono alcuni studi che presentano prove insufficienti per una correlazione definitiva tra EBV e amiloidosi maculare, quindi in base ai risultati del nostro studio potremmo fare questa conclusione.(2)Metodologia (PCR contro ibridazione in situ): abbiamo usato un metodo sensibile per il rilevamento di EBV DNA con controlli positivi e negativi. In base agli studi precedenti, la PCR è sensibile quanto l’ibridazione in situ. Tuttavia, poiché non abbiamo usato l’ibridazione in situ, non abbiamo potuto localizzare l’esatta cellula infettata da EBV nei nostri controlli, che potrebbero essere le cellule B circolanti della pelle invece dei cheratinociti. Poiché abbiamo usato controlli positivi e negativi nel nostro kit PCR per EBV, i casi positivi nel nostro gruppo di controllo non potevano essere falsi positivi.(3)Controlli: i controlli nel nostro studio erano la pelle sana intorno ai nevi melanocitici, ma i controlli nello studio di Chang erano altri disturbi cutanei.(4)Tipo di amiloidosi cutanea: nel nostro studio, tutti i pazienti avevano amiloidosi maculare, ma in entrambi gli studi precedenti la maggior parte dei pazienti erano di amiloidosi lichenica.
5. Conclusione
Secondo i risultati di questo studio, non c’era alcuna correlazione tra EBV e amiloidosi maculare. Raccomandiamo l’uso di tessuto fresco o di un punch da biopsia rapidamente congelato e lo studio sierologico simultaneo dei pazienti per gli anticorpi anti-EBV per ottenere risultati più accurati per lo studio comparativo dell’EBV DNA nell’amiloidosi maculare. La PCR in situ può anche essere usata per localizzare le cellule positive all’EBV DNA nei campioni. Altri geni possono essere usati per rilevare l’EBV nel tessuto poiché alcuni campioni di EBV sono mutati per il gene BLLF1 usato in questo studio.
Inoltre, si raccomanda di eseguire uno studio comparativo sulla rilevazione dell’EBV nella pelle coinvolta e non coinvolta dei pazienti con amiloidosi maculare.
Conflitto di interessi
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Riconoscimenti
Gli autori esprimono la loro profonda gratitudine per il delegato alla ricerca del MUMS per il sostegno finanziario e l’approvazione della proposta di ricerca (no. 911283) relativa alla tesi di Narges Nazeri. Il sostegno finanziario da parte del delegato alla ricerca dell’Università di Scienze Mediche di Mashhad è riconosciuto.