I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Reazione enzimatica (image will open in a new window)

Chymotrypsin è una serina endopeptidasi prodotta dalle cellule acinari del pancreas. La chimotripsina si attiva dopo la proteolisi del chimotripsinogeno da parte della tripsina. Mentre la tripsina idrolizza la lisina e l’arginina, la chimotripsina taglia selettivamente i legami peptidici formati da residui aromatici (tirosina, fenilalanina e triptofano) (Hedstrom et al. 1992). Due forme predominanti di chimotripsina, A e B, si trovano in quantità uguali nel pancreas dei bovini. Sono proteine molto simili (identiche all’80%), ma hanno caratteristiche proteolitiche significativamente diverse (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). Le informazioni che seguono riguardano principalmente la forma A del chimotripsinogeno e della chimotripsina.

Storia:

All’inizio del 1900, Vernon propose che i preparati pancreatici potessero dare origine a un attivatore intrinseco dei propri enzimi (Vernon 1901). Gli esperimenti di Vernon sulla coagulazione del latte determinarono che erano presenti almeno due enzimi e che uno era più stabile dell’altro (Vernon 1902). Tuttavia, questa idea non fu ampiamente accettata fino al 1934 quando Kunitz e Northrop confermarono la presenza di un enzima in aggiunta alla tripsina, chiamandolo chimotripsina. Furono in grado di cristallizzare la chimotripsina, così come il precursore inattivo, il chimotripsinogeno (Kunitz e Northrop 1934). Nel 1938, Kunitz isolò diverse forme attive di chimotripsina, designandole come alfa, beta e gamma (Kunitz 1938).

Nei primi anni 1940 Fruton e Bergmann studiarono ulteriormente la specificità della chimotripsina, riportando diversi nuovi substrati (Fruton e Bergmann 1942). Jacobsen identificò presto ulteriori forme di chimotripsina, designandole come delta e pi (Jacobsen 1947). Nel 1948, Schwert caratterizzò ulteriormente i pesi molecolari della chimotripsina e del chimotripsinogeno.

Nel 1954, la prima prova del meccanismo a tre fasi della chimotripsina che idrolizza substrati ammidici ed esteri fu riportata da Hartley e Kilby, che ipotizzarono la presenza di un intermedio acilico dell’enzima, che fu poi dimostrato essere vero (Henderson 1970). Nel 1955, Laskowski ottenne un secondo chimotripsinogeno cristallino, chiamandolo chimotripsinogeno B. Nel 1964 Hartley determinò la sequenza aminoacidica della chimotripsina A, che fu poi perfezionata da Meloun et al. nel 1966. Nel 1968, Smillie et al. determinarono la sequenza di aminoacidi della chimotripsina B, che rivelò un’identità di sequenza dell’80% con la chimotripsina A. Per tutti gli anni ’70 e ’80 sono state fatte ricerche per comprendere meglio il meccanismo d’azione e identificare le differenze nelle sequenze di aminoacidi tra tripsina e chimotripsina (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth e Polgár 1983, e Gráf et al. 1988).

Negli anni ’90, la chimotripsina è stata purificata da altre fonti tra cui il merluzzo atlantico (Ásgeirsson e Bjarnason 1991), e il cammello (Al-Ajlan e Bailey 1997). Si iniziò anche a studiare gli inibitori (Baek et al. 1990), e Frigerio et al. chiarirono la struttura cristallina della chimotripsina bovina con una risoluzione di 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Ricerche recenti hanno studiato il ripiegamento e la denaturazione della chimotripsina in una gamma di concentrazioni (Ghaouar et al. 2010), l’interazione della chimotripsina con substrati di nanoparticelle (You et al. 2006, e Jordan et al. 2009), e l’aumento della stabilità della chimotripsina attraverso la coniugazione con molecole PEG (Castellanos et al. 2005, e Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificità:

La chimotripsina viene attivata attraverso la scissione del legame tra arginina e isoleucina (R15 e I16) dalla tripsina, causando modifiche strutturali e la formazione del sito di legame del substrato (Sears 2010). La chimotripsina differisce dalla tripsina in quanto la tripsina taglia i peptidi a livello dei residui di arginina e lisina, mentre la chimotripsina preferisce i grandi residui idrofobici (Hedstrom et al. 1992). La chimotripsina catalizza preferibilmente l’idrolisi dei legami peptidici che coinvolgono gli isomeri L di tirosina, fenilalanina e triptofano. Agisce anche prontamente su ammidi ed esteri di amminoacidi suscettibili. La specificità della chimotripsina per i grandi residui idrofobici può essere spiegata da una zona di legame idrofobica S1 formata dai residui da 189 a 195, da 214 a 220, e da 225 a 228 (Cohen et al. 1981).

Anche se la struttura del sito S1 della tripsina e della chimotripsina mostrano solo una differenza (in posizione 189), la mutagenesi sito-diretta della tripsina e della chimotripsina non è riuscita a scambiare le specificità, suggerendo che il meccanismo con cui tripsina e chimotripsina raggiungono una catalisi specifica del substrato non è completamente compreso (Steitz et al. 1969, e Gráf et al. 1988).

Caratteristiche molecolari:

La chimotripsina A e B condividono l’80% di identità di sequenza (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). Gli amminoacidi della triade catalitica (H57, D102 e S195) sono altamente conservati nelle sequenze delle peptidasi della famiglia S1 (Gráf et al. 2004). Anche la serina in posizione 214 è altamente conservata nella famiglia ed è stata proposta come quarto membro della triade catalitica (Ohara et al. 1989, e McGrath et al. 1992).

Composizione:

I tre residui aminoacidici della triade catalitica (H57, D102, e S195) sono essenziali per la scissione del legame peptidico e sono stabilizzati da legami idrogeno (Sears 2010, e Gráf et al. 2004). G193 e S195 formano il foro dell’ossianione e interagiscono con il gruppo carbonile del legame peptidico scissile, orientandolo per formare l’intermedio tetraedrico (Rühlmann et al. 1973, Huber e Bode 1978, e Gráf et al. 2004).

Numero di accesso alla proteina: P00766

Classificazione CATH (v. 3.3.0):

• Classe: Principalmente Beta
• Architettura: Beta Barrel
• Topologia: Proteasi serinica simile alla tripsina

Peso molecolare:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

PH ottimale: 7.8-8.0 (Rick 1974)

Punto isoelettrico:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, teorico)
• 8.33 (Chymotrypsin, teorico)

Coefficiente di Estinzione:

• 51,840 cm-1 M-1 (teorico)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, teorico)
• E1%,280 = 20.57 (Chimotripsina, teorico)

Residui del sito attivo:

• Istidina (H57)
• Aspartato (D102)
• Serina (S195)

Attivatori:

• Bromuro di Cetiltributilammonio (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Bromuro di esadeciltrimetilammonio (Celej et al. 2004)
• Bromuro di tetrabutilammonio (Spreti et al. 2001)

Inibitori:

• Idrossimetilpirroli (Abell e Nabbs 2001)
• Acidi boronici (Smoum et al. 2003)
• Derivati della cumarina (Pochet et al. 2000)
• Aldeidi peptidiche (Lesner et al. 2009)
• Peptidi da fonti naturali (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, e Chopin et al. 2000)
• Peptidi contenenti un aminoacido non naturale (Legowska et al. 2009, e Wysocka et al. 2008)

Applicazioni:

• Analisi delle sequenze
• Sintesi peptidica
• Mappatura dei peptidi
• Impronta digitale peptidica