La clonazione molecolare è un insieme di tecniche usate per inserire DNA ricombinante da una fonte procariotica o eucariotica in un veicolo replicante come plasmidi o vettori virali. Il clonaggio si riferisce alla creazione di numerose copie di un frammento di DNA di interesse, come un gene. In questo video imparerai le diverse fasi della clonazione molecolare, come impostare la procedura, e le diverse applicazioni di questa tecnica.

Per iniziare la clonazione sono necessarie almeno due importanti molecole di DNA. In primo luogo, e più importante, è necessario il frammento di DNA che si sta per clonare, altrimenti noto come l’inserto. Può provenire da un procariote, un eucariote, un organismo estinto, o può essere creato artificialmente in laboratorio. Usando la clonazione molecolare possiamo imparare di più sulla funzione di un particolare gene.

In secondo luogo, è necessario un vettore. Un vettore è il DNA plasmidico usato come strumento in biologia molecolare per fare più copie o produrre una proteina da un certo gene. I plasmidi sono un esempio di un vettore, e sono circolari, extra cromosomici, DNA che viene replicato dai batteri.

Un plasmide ha tipicamente un sito di clonazione multiplo o MCS, quest’area contiene siti di riconoscimento per diverse endonucleasi di restrizione conosciute anche come enzimi di restrizione. Inserti diversi possono essere incorporati nel plasmide con una tecnica chiamata legatura. Il plasmide vettore contiene anche un’origine di replicazione, che gli permette di essere replicato nei batteri. Inoltre, il plasmide ha un gene antibiotico. Se i batteri incorporano il plasmide, sopravviveranno in mezzi che contengono l’antibiotico. Questo permette la selezione dei batteri che sono stati trasformati con successo.

L’inserto e il vettore sono clonati in un organismo cellulare ospite, il più comunemente usato nella clonazione molecolare è E. coli. E. coli cresce rapidamente, è ampiamente disponibile e ha numerosi vettori di clonazione diversi prodotti commercialmente. Anche gli eucarioti, come il lievito, possono essere usati come organismi ospiti per i vettori.

Il primo passo della procedura generale di clonazione molecolare è quello di ottenere l’inserto desiderato, che può essere derivato da DNA o mRNA da qualsiasi tipo di cellula. Il vettore ottimale e il suo organismo ospite sono poi scelti in base al tipo di inserto e a ciò che sarà fatto con esso. Una reazione a catena della polimerasi, o metodo basato sulla PCR, è spesso usata per replicare l’inserto.

Poi, usando una serie di reazioni enzimatiche, l’inserto e il digest sono uniti insieme e introdotti nell’organismo ospite per la replicazione di massa. I vettori replicati sono purificati dai batteri e, dopo la digestione di restrizione, analizzati su un gel. I frammenti purificati su gel vengono successivamente inviati al sequenziamento per verificare che l’inserto sia il frammento di DNA desiderato.

Diamo un’occhiata più dettagliata a come viene condotto il clonaggio molecolare. Prima di iniziare, vorrete pianificare la vostra strategia di clonazione, prima di fare qualsiasi tentativo di clonazione al banco. Per esempio, qualsiasi vettore plasmidico dato, vi fornirà un numero finito di siti di restrizione per incorporare l’inserto attraverso il sito di clonazione multipla. Avrete bisogno di scegliere siti di restrizione che non si trovano nel vostro inserto in modo da non scinderlo. Potreste trovarvi in una situazione in cui siete costretti a unire un frammento di estremità smussato con uno che ha una sporgenza. Se è così, allora usare il frammento klenow per impostare una legatura blunt end potrebbe essere la vostra unica opzione per ottenere l’inserto nel vettore desiderato. Comprendere i vari strumenti di clonazione molecolare a vostra disposizione, così come venire con una strategia attenta prima di iniziare la clonazione può essere un immenso risparmio di tempo.

La fonte di DNA per la clonazione molecolare può essere isolata da quasi qualsiasi tipo di campione di cellule o tessuti attraverso semplici tecniche di estrazione. Una volta isolato, la PCR può essere usata per amplificare l’inserto.

Una volta che l’inserto è amplificato, sia esso che il vettore vengono digeriti dagli enzimi di restrizione, noti anche come endonucleasi di restrizione.

Una volta digeriti, l’inserto e il vettore possono essere messi su un gel e purificati con un processo chiamato purificazione del gel. Per quanto riguarda il vettore, questo passo aiuterà a purificare il plasmide linearizzato dal plasmide non tagliato, che tende ad apparire come uno striscio ad alto peso molecolare su un gel.

Dopo aver purificato i digest su gel, l’inserto viene legato o unito al plasmide, tramite un enzima chiamato DNA ligasi.

In generale, è sempre una buona idea impostare le legature in modo che il rapporto tra inserto e vettore sia di 3 a 1, il che assicura che solo una piccola quantità di vettore si auto-leghi. Una volta che la legatura è stata impostata su ghiaccio, viene incubata ovunque da 14-25˚C da 1 ora a tutta la notte.

In seguito, viene eseguita la trasformazione per introdurre il vettore plasmidico nell’ospite che lo replicherà.

Dopo la trasformazione i batteri vengono piastrati su piastre di agar con antibiotico e incubati per una notte a 37°C. Poiché il plasimide contiene un gene di resistenza agli antibiotici, una trasformazione di successo produrrà colonie batteriche quando coltivate su piastre di agar in presenza di antibiotici. Le singole colonie possono quindi essere prelevate dalla piastra trasformata, messe in mezzi di crescita liquidi in provette numerate, e messe in un incubatore ad agitazione per l’espansione. Un piccolo volume di cultura liquida viene aggiunto a una piastra di agar numerata, mentre il resto della cultura passa alla purificazione del plasmide. Lo schema di numerazione che denota l’identità delle colonie batteriche da cui i plasmidi saranno infine purificati viene mantenuto durante tutto il processo di purificazione dei plasmidi.

Un campione di plasmide purificato viene poi tagliato con enzimi di restrizione. Il digest viene poi caricato ed eseguito sul gel al fine di verificare la presenza di inserto, che verificherà che la colonia batterica è stata trasformata con un plasmide contenente un inserto e non plasmide auto-legato. I batteri verificati per essere stati trasformati con un plasmide contenente un inserto, vengono espansi per un’ulteriore purificazione del plasmide. Il sequenziamento viene utilizzato come fase di verifica finale per confermare che il gene di interesse è stato clonato.

La clonazione molecolare può essere utilizzata per un numero quasi illimitato di applicazioni. Per esempio, quando un modello di mRNA viene trascritto inversamente per formare cDNA, o DNA complementare, da un enzima chiamato trascrittasi inversa e poi la PCR viene utilizzata per amplificare il cDNA, la clonazione molecolare può essere utilizzata per creare una libreria di cDNA – una libreria di tutti i geni espressi da un dato tipo di cellula.

La clonazione molecolare può anche essere impiegata per prendere una serie di geni, o un gruppo di geni da un ceppo batterico, riorganizzarli in plasmidi che vengono trasformati in un altro ceppo, così un intero percorso biosintetico può essere ricreato per produrre una molecola complessa.

Attraverso la clonazione molecolare, una biblioteca mutante può essere generata esprimendo un plasmide bersaglio in un ceppo batterico speciale che usa una polimerasi soggetta a errori quando coltivata a certe temperature. Le mutazioni possono essere caratterizzate dal sequenziamento. I batteri trasformati con i geni mutanti possono poi essere testati con diversi farmaci o sostanze chimiche per vedere quali colonie batteriche si sono evolute per avere resistenza ai farmaci.

Grazie alla clonazione molecolare, i geni reporter possono essere incorporati in plasmidi di DNA, un gene reporter comune è la proteina verde fluorescente o GFP, che emette una fluorescenza verde quando esposta alla luce UV. Un gene reporter può anche essere inserito in un alphavirus per mostrare l’infezione nelle zanzare e la trasmissibilità nelle cellule.

Hai appena visto il video di JoVE sulla clonazione molecolare. Ora dovresti capire come funziona la clonazione molecolare e come la tecnica può essere utilizzata in biologia molecolare. Come sempre, grazie per aver guardato!