2.19.2.3.3 Condizioni di eluizione
Le soluzioni di eluizione efficaci dovrebbero idealmente interrompere le interazioni analita-anticorpo senza influenzare negativamente gli Abs immobilizzati. Un dislocatore è una molecola cross-reagente altamente concentrata in grado di indurre un desorbimento biospecifico. Le molecole del dislocatore competono con le molecole dell’analita legate, e il grande eccesso di dislocatore assicura un desorbimento quantitativo dell’analita. Per una prestazione ottimale, il dislocatore deve soddisfare diversi criteri: (1) un’elevata cross-reattività con gli anticorpi immobilizzati, (2) un tempo di ritenzione significativamente diverso da quello degli analiti perché il grande eccesso causa un picco prominente che può facilmente interferire con la rilevazione degli analiti, (3) una buona stabilità ed elevata purezza perché le impurità presenti a livelli bassi come 0,01-0,1% possono disturbare il cromatogramma, e (4) basso prezzo, caratteristiche non tossiche, assenza in campioni reali, e bassa rilevabilità rispetto agli analiti. Inoltre, è necessario un grande volume di soluzione di eluizione, che impone la riconcentrazione su un supporto SPE classico prima dell’analisi. Di conseguenza, le condizioni di eluizione che permettono il recupero completo dell’analita target con un piccolo volume di eluizione sono preferite.
Gli ioni caotropici sono comunemente utilizzati per l’eluizione di grandi molecole come le proteine. Questi ioni interrompono la struttura dell’acqua intorno alle grandi molecole, cioè gli anticorpi e le molecole bersaglio, che induce una rottura delle interazioni idrofobiche nelle strutture delle grandi molecole e tra l’analita e l’anticorpo. Gli ioni caotropici più comuni sono ioni cloruro, ioduro, perclorato e tiocianato, a concentrazioni comprese tra 1,5 e 8 mol l-1. Tuttavia, le varie soluzioni acquose che possono essere applicate con successo per il desorbimento delle proteine da IS hanno dimostrato di non essere in grado di desorbire piccole molecole. Il desorbimento della proteina è probabilmente basato principalmente sui cambiamenti nella struttura della proteina legata (denaturazione parziale), e non sui cambiamenti nella struttura degli anticorpi immobilizzati. Pertanto, l’eluizione delle piccole molecole, che non sono sensibili alla denaturazione, richiede condizioni molto più rigorose. Inoltre, con un aumento della temperatura da 4 a 43 °C, la costante di dissociazione delle interazioni anticorpo-analita può essere aumentata di due ordini di grandezza. Questo metodo non è sufficientemente efficace per essere applicato all’eluizione di piccole molecole. L’eluizione con soluzioni a basso pH viene spesso eseguita per desorbire piccole molecole dall’IS, ma sono necessarie tre unità di pH dal punto isoelettrico dell’anticorpo. Questo tipo di eluizione (spostamento del pH senza alterare la forza ionica) evita di danneggiare gli anticorpi labili. Un inconveniente è che grandi volumi sono ancora necessari per il desorbimento completo, diminuendo così i fattori di arricchimento associati con le procedure di estrazione.
Un efficiente eluizione di piccole molecole da un IS può essere ottenuto con un volume ridotto di una miscela di modificatore acqua-organica. Come esempio, la figura 6 presenta il profilo di eluizione di due erbicidi, isoproturone e atrazina, dopo la percolazione di un campione di acqua con ogni analita sul suo corrispondente IS. Sono stati valutati diversi solventi di eluizione (metanolo, etanolo e ACN) mescolati con acqua.
Figura 6. Profili di eluizione di atrazina, isoproturone, 2,4,6-triclorofenolo e pentaclorofenolo dai loro corrispondenti IS utilizzando soluzioni di eluizione contenenti quantità crescenti di un solvente organico in acqua acidificata o non acidificata dopo la percolazione di campioni d’acqua con spike per ogni analita. ACN, acetonitrile; MeOH, metanolo; EtOH, etanolo; AA, acido acetico; TFA, acido trifluoroacetico. I tre solventi testati permettono l’eluizione completa di entrambi gli analiti. Tuttavia, l’ACN presenta la maggiore forza di eluizione: il contenuto più basso di questo solvente fornisce l’eluizione completa di entrambi gli analiti. Un contenuto di ACN del 40% e del 60% è sufficiente per recuperare l’isoproturone e l’atrazina, rispettivamente, mentre sono necessari il 60% e l’80% di metanolo. In questo caso, la forza di eluizione del solvente sembra essere legata alla sua natura idrofoba, ACN (parametro di solubilità Hildebrand δ = 24,3 MPa1/2) essendo meno polare di etanolo (δ = 26,0 MPa1/2) e metanolo (δ = 29,7 MPa1/2). Questi risultati sembrano indicare che le interazioni tra gli erbicidi e i loro corrispondenti anticorpi sono principalmente di natura idrofobica. La presenza di solventi non polari riduce la componente di legame idrofobico dell’interazione anticorpo-analita. Tuttavia, influenza anche la stabilità dei legami idrofobici, mantenendo la struttura terziaria dell’anticorpo, e provoca il rilascio dell’antigene. Questi esempi relativi all’eluizione di atrazina o di isoproturone dai loro corrispondenti IS mostrano che un’eluizione efficiente sarà ottenuta aggiungendo direttamente un’elevata quantità di metanolo o ACN, 70-80%, nella frazione di eluizione. Questa elevata quantità di modificatore organico permetterà di ridurre il volume della frazione di eluizione il più possibile, permettendo così la concentrazione dell’analita nell’eluato. Bisogna fare attenzione che la scelta della modalità di legame sia compatibile con queste condizioni di eluizione. L’uso del legame non covalente impedisce la possibilità di applicare una quantità così elevata di modificatore senza il rischio di interrompere il legame degli anticorpi dal sorbente. L’uso di un processo sol-gel per l’immobilizzazione degli anticorpi limita anche la possibilità di usare una grande quantità di solvente organico. È stato dimostrato che una grande quantità di modificatore organico come gli anticorpi causa la lisciviazione degli anticorpi dalla matrice sol-gel.8
A volte è necessaria una combinazione di solvente organico e acido organico. La figura 6 presenta anche il profilo di eluizione del 2,4,6-triclorofenolo e del pentaclorofenolo da un IS anti-pentaclorofenolo utilizzando una miscela idro-organica con e senza l’aggiunta di un acido alla soluzione eluente. Il triclorofenolo potrebbe essere completamente recuperato utilizzando acqua/ACN (20:80, v/v) o acqua/ACN (30:70, v/v) acidificato a pH 3 utilizzando acido trifluoroacetico (TFA). Quando l’acidificazione è stata ottenuta con l’1% (v/v) di acido acetico (AA), una miscela contenente solo il 30% di ACN era efficace per l’eluizione. Al contrario, l’eluizione del pentaclorofenolo, che ha una maggiore affinità per i PAbs rispetto al triclorofenolo, era impossibile con ACN puro o ACN acidificato da TFA. Il desorbimento poteva essere ottenuto solo con acqua/ACN 20:80 (v/v) contenente l’1% di AA (v/v).
Pertanto, nella maggior parte delle procedure off-line, comprese quelle raccomandate utilizzando gli IS commerciali monouso, il desorbimento si ottiene con un’alta percentuale di un solvente organico, a volte a basso pH.
In conclusione, la scelta delle condizioni di eluizione dipende innanzitutto dall’affinità tra anticorpi e analiti. Dipende anche dalla natura dell’analita, a causa del rapporto tra interazioni elettroniche e idrofobiche coinvolte nelle interazioni antigene-anticorpo. Infine, dipende dalla strategia di immobilizzazione degli anticorpi; il legame non covalente impedisce l’uso di grandi quantità di solventi organici.