Cultura cellulare, amplificazione del virus e purificazione per gli esperimenti SHAPE-MaP e SPLASH
Le cellule del rene bovino di Madin-Darby (MDBK) e del rene canino di Madin-Darby (MDCK) sono state coltivate in Minimum Essential Medium (Merck), integrato con 2 mM l-glutamina e 10% FCS. Gli stock di virus WSN (H1N1) sono stati prodotti infettando le cellule MDBK con il virus dell’influenza ad una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01. Gli stock virali dei virus Udorn (H3N2) e PR8 (H1N1) (PR8) sono stati prodotti infettando le cellule MDCK ad un MOI di 0.001 in presenza di 0.8 μg ml-1 di n-Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) trattata con tripsina (Merck). I virus sono stati raccolti 2 d post-infezione. I virus sono stati purificati mediante ultracentrifugazione: in primo luogo, il mezzo di coltura cellulare infetto è stato chiarito mediante centrifugazione a 4.000 giri per 10 minuti a 4 °C seguita da centrifugazione a 10.000 giri per 15 minuti a 4 °C. Il virus è stato poi purificato mediante centrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio al 30% a 25.000 giri per 90 minuti a 4 ° C in un rotore SW 32 (Beckman Coulter). Il pellet di virus purificato è stato risospeso in un tampone di risospensione (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Notiamo che né virione né strutture terziarie RNA sono interrotti da ultracentrifugazione30,31,32.
SHAPE-MaP
SHAPE-MaP è stata eseguita secondo procotols pubblicato17; 1-metil-7-nitroisatoic anidride (1M7) è stato sintetizzato da 4-nitroisatoic anidride come descritto precedentemente33. Per gli esperimenti di RNA trascritto in vitro, ogni segmento di RNA virale è stato sintetizzato da un modello di DNA lineare utilizzando il HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). I prodotti sono stati controllati per le dimensioni e la purezza su un gel di elettroforesi di poliacrilammide (PAGE) al 3,5%. Campioni di RNA virale nudo sono stati preparati purificando le particelle WSN su cuscino di saccarosio come descritto in precedenza. Virus purificati sono stati trattati con 250 μg ml-1 di proteinasi K (Roche) in tampone proteinasi K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) per 40 min a 37 ° C. Prima della modifica, in vitro trascritto RNA e campioni di RNA virale nudo sono stati piegati a 37 ° C per 30 min in tampone pieghevole (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (sciolto in dimetilsulfossido anidro (DMSO; Merck)) è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 10 mM per l’RNA piegato e i campioni sono stati incubati per 75 s a 37 ° C. Le modifiche in virio sono state eseguite aggiungendo 1M7 direttamente al virus purificato. La capacità di SHAPE-MaP reagenti di penetrare le particelle virali è stato inizialmente testato come descritto in precedenza34 eseguendo 32P-marcato estensioni primer su RNA estratto dal SHAPE-MaP reagente-trattato virus utilizzando un segmento NA-targeting primer (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). In parallelo ai campioni trattati con 1M7, i campioni di controllo sono stati trattati con DMSO. n-metilisatoic anidride (NMIA; Thermo Fisher Scientific) reagente SHAPE-MaP è stato testato anche in virio. Esperimenti con NMIA sono stati eseguiti come descritto per 1M7, tranne i virioni purificati sono stati trattati con NMIA per 45 min.
Sequencing preparazione biblioteca è stata effettuata come descritto in precedenza17 secondo il flusso di lavoro randomer. In breve, dopo 1M7 o trattamento di controllo, RNA è stato purificato utilizzando il RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research). L’RNA è stato invertito-trascritto utilizzando il Random Primer Mix (New England Biolabs) con SuperScript II (Invitrogen) in tampone MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiotreitolo e 0,5 mM deossinucleoside trifosfato). Il Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) è stato utilizzato per preparare le librerie di DNA. Prodotti finali di amplificazione PCR sono stati selezionati per dimensioni utilizzando Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) e qualità valutata con il kit Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) su un sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Per WSN, RNA virale nudo e RNA trascritto in vitro, le librerie sono state sequenziate (2 × 150 coppie di basi (bp)) su un sistema HiSeq 4000 (Illumina); per i virus PR8 e Udorn, le librerie sono state sequenziate (1 × 150 bp) su un sistema NextSeq 500 (Illumina).
SPLASH
SPLASH campioni sono stati preparati come pubblicato in precedenza24,35, con alcune modifiche, per due replicati ciascuno dei virus WSN, PR8 e Udorn e una singola replica per ciascuno dei virus riassortiti H3N2. Virus purificato è stato incubato con 200 μM di EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina (Thermo Fisher Scientific) e 0,01% digitonina (Merck) per 5 minuti a 37 ° C. Virus è stato diffuso su un piatto da 6 pozzetti, coperto con una piastra di vetro, posto su ghiaccio e irradiato per 45 min utilizzando un UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific). Il virus reticolato è stato trattato con proteinasi K e l’RNA virale è stato estratto utilizzando TRIzol (Invitrogen). Un’aliquota di RNA virale estratto è stato utilizzato per rilevare l’incorporazione di biotina utilizzando un modulo di rilevamento dell’acido nucleico chemiluminescente Kit (Thermo Fisher Scientific) su una membrana di nylon Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). Il resto dell’RNA virale estratto è stato frammentato utilizzando il NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) e size-selected per frammenti più brevi di 200 nt utilizzando il RNA Clean & Concentrator-5 Kit. I campioni sono stati arricchiti per l’RNA virale biotinilato utilizzando Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perline (Thermo Fisher Scientific); on-bead legatura di prossimità e psoralene-cross-link inversione sono stati eseguiti come pubblicato in precedenza 24,35. Librerie di sequenziamento sono stati preparati utilizzando il commerciale SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). Selezione finale dimensione è stato fatto eseguendo la PCR-amplificato librerie di sequenziamento su un gel PAGE 6% (Thermo Fisher Scientific) in Tris / acido borico / EDTA (TBE), selezionando per 200-300 bp DNA. Le librerie sono state sequenziate 1 × 150 bp su un sistema NextSeq 500.
Trattamento delle letture di sequenziamento SHAPE-MaP
Le letture di sequenziamento sono state tagliate per rimuovere gli adattatori utilizzando Skewer v0.2.2 (rif. 36). I profili di reattività SHAPE-MaP sono stati generati utilizzando la pipeline pubblicata ShapeMapper237, che allinea le letture al genoma di riferimento e calcola i tassi di mutazione in ogni posizione di nucleotide. I tassi di mutazione sono poi convertiti in SHAPE-MaP valori di reattività definiti come:
Elaborazione delle letture di sequenziamento SPLASH
Le letture di sequenziamento sono state tagliate per rimuovere gli adattatori usando Skewer v0.2.2 (rif. 36). STAR v.2.5.3 (rif. 38) è stato utilizzato per allineare le letture al genoma di riferimento del virus appropriato (Tabella 2 supplementare). Solo le letture chimeriche in cui almeno 20 nt allineati ai segmenti di riferimento sono stati utilizzati in ulteriore elaborazione (parametro STAR: -chimSegmentMin 20). Le letture chimeriche sono state deduplicate usando le stringhe CIGAR e le posizioni di allineamento. Le stringhe CIGAR in ogni allineamento di lettura sono state elaborate per trovare le coordinate di inizio e fine della lettura. Le coordinate della lettura chimerica sono state utilizzate per produrre una matrice di interazioni di sequenza nel software R. I loci discreti nella matrice sono stati selezionati e adattati individualmente con una curva gaussiana basata sull’intensità della sovrapposizione di lettura per definire una finestra di interazione; le finestre di interazione dei loci complessi sovrapposti sono state separate in finestre individuali. La larghezza della finestra di interazione è stata utilizzata per determinare le coordinate di inizio e fine di ogni interazione; il numero di letture che erano all’interno (o parzialmente all’interno) di questa regione è stato utilizzato come misura della frequenza di interazione. Per la generazione di figure, le prime 20 interazioni in ogni virus sono state visualizzate utilizzando il pacchetto circlize v.0.4.5 (rif. 39) in R v.3.5.1. L’insieme completo dei loci di interazione è fornito nella tabella supplementare 2. Per la convalida qPCR di loci di interazione, psoralene-cross-linked campioni sono stati preparati e arricchiti come descritto in precedenza, ma con un tempo di frammentazione ridotto (3 contro 4 min) per generare frammenti di RNA più lunghi. L’RNA è stato poliadenilato con Poly(A) Polymerase (Takara Bio) e il DNA complementare è stato generato utilizzando il primer smRNA dT (Takara Bio) e PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) secondo le istruzioni del produttore. Un ciclo di 50 qPCR è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore su uno strumento StepOnePlus (Applied Biosystems) utilizzando il Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix con ROX (Agilent Technologies) e coppie di primer per verificare le interazioni tra i segmenti. Sequenze di primer sono riportati nella tabella 3 supplementare. Dopo 50 cicli di amplificazione qPCR, i prodotti sono stati risolti da 8% PAGE (29:1 acrilamide / bis-acrilamide, 1 × tampone TBE) e visualizzati con transilluminazione luce blu.
Previsioni struttura RNA
L’algoritmo IntaRNA v.2.3.1 (rif. 40) è stato utilizzato per prevedere la capacità delle interazioni RNA-RNA di verificarsi nelle regioni identificate durante l’analisi SPLASH, utilizzando le opzioni Exact mode (-mode E) e no seed constraint (-noSeed). Le reattività SHAPE-MaP sono state incluse nella modellazione delle interazioni RNA-RNA (-tShape e -qShape). Set di dati permutati sono stati generati mescolando casualmente i partner di interazione specifici identificati da SPLASH e valutando le energie ΔG di interazione utilizzando IntaRNA. La significatività della differenza tra le distribuzioni di probabilità delle energie ΔG associate alle interazioni RNA intermolecolari identificati da SPLASH rispetto ai set di dati permutati è stato calcolato utilizzando il test di Wilcoxon rank-sum nel software R. Le previsioni della struttura IntaRNA sono state poi utilizzate per tagliare le regioni di interazione ai nucleotidi coinvolti nell’accoppiamento di base. Quando i dati SHAPE-MaP non erano disponibili (riassortimenti PR8 con virus H3N2), il pre-folding di ogni filamento di RNA (‘accessibilità’) è stato disabilitato in IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Per la convalida rispetto alle strutture note, i dati della struttura secondaria dell’RNA sono stati estratti dal database RNA3Dhub41, sulla base delle strutture al microscopio elettronico criogenico del ribosoma 80S42 (PDB: 6EK0) e dal complesso spliceosomale U4/U6.U5 triplo piccolo ribonucleoproteina nucleare43 (EMDB: EMD-2966). Sequenze di riferimento RNA sono stati corretti per abbinare bovino (MDBK) sequenze per RNA ribosomiale e U4/U6 piccoli RNA nucleare come descritto in precedenza44. Per le previsioni struttura intramolecolare RNA, il ViennaRNA pacchetto v.2.0 (rif. 45) è stato utilizzato. Il comando RNAfold è stato utilizzato per prevedere strutture secondarie di RNA e funzioni di partizione per ogni segmento. Le reattività SHAPE-MaP sono state incluse come vincoli pseudoenergetici. Un 50 nt scorrevole finestra mediana analisi di correlazione tra il ex virio e in virio SHAPE-MaP reattività profili è stato utilizzato per determinare l’entità della SHAPE-MaP correlazione tra T7 trascritto e vRNP-associati RNA. Abbiamo trovato che nessuna correlazione esisteva >150 nt; quindi, abbiamo impostato il vincolo di massima distanza di accoppiamento per la struttura e le previsioni di funzione di partizione a 150 nt. Per le previsioni della struttura intramolecolare, abbiamo impostato i nucleotidi all’interno della regione del promotore per essere a singolo filamento.
Cultura cellulare per la reverse-engineering dei virus dell’influenza
Le cellule MDCK e le cellule di rene embrionale umano (HEK 293T) sono state prelevate da una collezione esistente nel Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Università di Melbourne. Le cellule MDCK sono state coltivate in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Sigma-Aldrich) e le cellule HEK 293T sono state coltivate in DMEM (Thermo Fisher Scientific). Entrambi i mezzi sono stati integrati con 10% FCS inattivato al calore, 2 mM l-glutamina, 2 mM piruvato di sodio, 24 μg ml-1 gentamicina, 50 μg ml-1 streptomicina e 50 IU ml-1 penicillina. Cocolture di cellule MDCK e cellule HEK 293T per la trasfezione sono stati stabiliti in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) con 50 μg ml-1 streptomicina e 50 IU ml-1 penicillina.
Costruzione di virus influenzali inversi
I singoli segmenti genici dai virus PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) e Wyo03 (H3N2) sono stati invertiti e clonati in plasmidi pHW200046. I virus derivati dalla genetica inversa contenevano un gene PR8, Udorn, Mem71, PC73 o Wyo03 PB1 con un gene NA wild-type o modificato in un background genetico che comprendeva sei segmenti del virus PR8 (PB2, PA, HA, NP, M e NS). Il gene NA modificato (Wyo03UdSub) era derivato da Wyo03 e portava 4 sostituzioni verso la sequenza Udorn-NA: nucleotidi G943A; C938U; U933C; e G923A. Tre di questi quattro cambiamenti nucleotidici erano silenziosi, con il quarto (A534G) che risulta in un cambiamento conservativo da lisina ad arginina (K172R). Frammenti complementari che incorporano questi cambiamenti sono stati generati da PCR e uniti insieme da un altro giro di PCR utilizzando primer segmento-specifici contenenti siti di restrizione BsmBI47; il prodotto è stato clonato nel vettore di espressione pHW2000 per il salvataggio del virus. Sequenze di primer sono riportati nella tabella supplementare 3. I virus salvati sono stati amplificati in 10-d uova di gallina embrionate. Fluido allantoico infettivo è stato titolato per il contenuto del virus dalla formazione di placche in cellule MDCK48 e conservati a -80 ° C.
Determinazione della cinetica di replicazione virale dei virus invertiti
Le caratteristiche di replicazione dei virus invertiti sono stati determinati infettando cellule MDCK ad un MOI di 0,01. Dopo 1 h di assorbimento (a t = 0 h) l’inoculo è stato rimosso e le cellule sono state lavate e incubate a 37 °C, 5% CO2 in RPMI 1640 integrato con 2 mM l-glutamina, 2 mM sodio piruvato, 24 μg ml-1 gentamicina, 50 μg ml-1 streptomicina, 50 IU ml-1 penicillina e 1 μg ml-1 di tripsina trattata con TPCK (Worthington Biochemical Corporation). I surnatanti delle colture cellulari sono stati raccolti in vari punti temporali dopo l’infezione e conservati a -80 °C per l’analisi. Titoli virali sono stati determinati dalla formazione di placche su monostrati confluenti di cellule MDCK.
Nine-plasmide competitivo reverse-engineering di virus influenzali
Competitive reverse-engineering di virus influenzali è stato intrapreso utilizzando una versione modificata del sistema a otto plasmidi reverse genetics26 come descritto precedentemente25. In breve, i plasmidi che codificano i segmenti di RNA virale PB2, PB1, PA, emoagglutinina (HA), nucleoproteina (NP), proteina della matrice (M) e proteina non strutturale (NS) di PR8 sono stati cotrasfettati con plasmidi che codificano l’RNA virale della neuraminidasi (NA) e RNA virale PB1 concorrente di Udorn, Mem71, PC73 o Wyo03 wild-type o modificato. Ogni plasmide (1 µg) è stato mescolato con il reagente di trasfezione FuGENE 6 (Promega) in Opti-MEM e aggiunto a una cocoltura di cellule HEK 293T e MDCK. Sei ore dopo la trasfezione, i media sono stati sostituiti con Opti-MEM integrato con 50 μg ml-1 streptomicina e 50 IU ml-1 penicillina. Ventiquattro ore dopo, la tripsina trattata con TPCK (1 μg ml-1) è stata aggiunta e il surnatante raccolto dopo altre 42 ore e conservato a -80 °C. Per determinare le frequenze di incorporazione dei geni concorrenti PB1, i virus progenie nel surnatante trasfezione sono stati sottoposti a un test di placca in cellule MDCK. Le placche scelte a caso (circa 36 per esperimento) sono state raccolte per campionamento attraverso l’agarosio e risospese in 0,05% Triton-X100. La fonte dei segmenti di gene concorrenti è stato identificato da gene-specifica RT-PCR quantitativa utilizzando il SensiFast sonda no-ROX one-step RT-PCR Kit (Bioline). Ogni 20 microlitri di reazione è stata eseguita utilizzando 5 microlitri di placca-prelevato sospensione del virus, 10 microlitri di 2 × SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0,2 microlitri di trascrittasi inversa, 0,4 microlitri di inibitore RNase Ribosafe, 0,8 microlitri di ogni 10 microlitri gene-specifico primer forward e reverse e 0,08 microlitri di ogni 25 microlitri gene-specifico sonda. Sequenze di primer e sonda sono riportati nella tabella 3 supplementare. La reazione RT-PCR è stata incubata per 10 minuti a 45 ° C, prima di procedere con l’amplificazione qPCR, secondo le istruzioni del produttore. I valori riportati sono dati combinati da 3-8 esperimenti di trasfezione indipendenti per ogni competizione.
Reporting Summary
Ulteriori informazioni sul progetto di ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.