L’albumina umana da siero Proprietà chimiche, usi, produzione
Proprietà chimiche
solide
Metodi di purificazione
L’albumina viene purificata mediante dissoluzione in acqua di conducibilità e passaggio a 2-4o attraverso due colonne a scambio ionico, ciascuna contenente una 2:1 di resine anioniche e cationiche (Amberlite IR-120, forma H, Amberlite IRA-400, forma OH). Questo trattamento rimuove gli ioni e le impurità lipidiche. Si fa attenzione ad escludere la CO2 e la soluzione viene conservata a -15o. Una rimozione più completa dei lipidi si ottiene liofilizzando la soluzione deionizzata, coprendo l’albumina essiccata (siero umano) con una miscela di acido acetico glaciale al 5% (v/v) in iso-ottano (precedentemente essiccata con Na2SO4) e lasciandola a 0o (senza agitazione) per più di 6 ore prima di decantare e scartare la miscela di estrazione, lavare con iso-ottano, ri-estrarre e infine lavare due volte con iso-ottano. L’albumina purificata viene essiccata sotto vuoto per diverse ore, poi dializzata contro acqua per 12-24 ore a temperatura ambiente, liofilizzata e conservata a -10oC . È stata ricristallizzata in soluzioni di EtOH alto (35%) e basso (22%) dalla Frazione V di Cohn. La ricristallizzazione in EtOH alto è la seguente: A 1kg di pasta di albumina della Frazione V a -5o si aggiungono 300mL di tampone acetato 0.4 M pH (pH 5.5) in 35% EtOH pre-raffreddato a -10o e 430 mL di 0.1 M NaOAc in 25% EtOH sempre a -10o. I migliori risultati si ottengono aggiungendo tutto il tampone e circa la metà del NaOAc e mescolando lentamente per 1 ora. Il resto del NaOAc viene aggiunto quando tutti i grumi si sono disintegrati. La miscela è messa da parte a -5o per diversi giorni per cristallizzare. Il 35% di EtOH (1 L) viene quindi aggiunto per diluire la sospensione cristallina e abbassare la forza ionica prima della centrifugazione a -5o (resa 80%). I cristalli sono ulteriormente disciolti in 1,5 volumi di EtOH al 15%/0.02M NaCl a -5o e chiarificati per filtrazione attraverso terra diatomacea lavata e calcinata. Questa soluzione può essere ricristallizzata riadattandola alle condizioni della prima cristallizzazione, oppure può essere ricristallizzata al 22% di EtOH con l’aiuto di una piccolissima quantità di decanolo (abbastanza per dare una concentrazione finale dello 0,02%). Si noti che la cristallizzazione a bassa concentrazione di EtOH ha dato una migliore purificazione (cioè rimuovendo le globuline e i carboidrati) e producendo un prodotto più stabile. La ricristallizzazione da EtOH basso è la seguente: A 1kg di Frazione V a -10o a -15o si aggiungono 500mL di 15% EtOH a -5o, mescolando lentamente fino a formare una sospensione uniforme. All’EtOH al 15% (500mL) viene aggiunta una soluzione di NaHCO3 0.2M sufficiente (125-150mL) a 0o per portare il pH (diluizione 1:10) a 5.3. Si verifica un certo aumento di temperatura, e bisogna fare attenzione a mantenere la temperatura dell’albumina del siero umano Prodotti di preparazione e materie prime