Abstract
Il presente lavoro presenta una descrizione dettagliata dell’ultrastruttura delle cellule secretorie delle isole pancreatiche del pesce gatto sudamericano Rhamdia quelen. Vengono offerte prove a sostegno della tesi che gli α-granuli sono costituiti da una porzione centrale e una esterna di diversa densità elettronica e solubilità, che le cellule δ sono molto probabilmente cellule α morfologicamente alterate ma vitali, e che i β-granuli possiedono forse una sottostruttura ripetitiva e possono quindi rappresentare una forma di stoccaggio cristallino intracellulare di insulina.
1. Introduzione
Le isole di Langerhans sono state scoperte nel coniglio da Langerhans nel 1869. Tuttavia, sono stati riportati da Stannius e Blockmann nei teleostei circa 20 anni prima e quindi sono anche, sebbene meno frequentemente, indicati come corpi di Stannius o Blockmann. Gli isolotti di Langerhans sono di origine endodermica e nella maggior parte dei teleostei si trovano come piccoli corpi sparsi nella porzione esocrina del pancreas.
Il pesce non ha un pancreas discreto. Il tessuto pancreatico esocrino può essere trovato sparso lungo il tratto intestinale. La struttura acinare del pancreas esocrino è molto simile a quella dei mammiferi e comprende cellule con un citoplasma molto scuro e basofilo. Nei pesci che si nutrono attivamente, contengono un gran numero di granuli secretori eosinofili brillanti. L’isolotto pancreatico endocrino di Langerhans potrebbe essere distinto, e il tessuto comprende cellule α (che producono peptide simile al glucagone), cellule β (che producono insulina), e cellule d (che producono somatostatina). Nei mammiferi e nell’uomo la maggior parte delle precedenti descrizioni al microscopio elettronico delle isole pancreatiche umane adulte sono state brevi e porzioni minori di pubblicazioni sono principalmente dedicate a descrizioni di tumori delle cellule β o articoli di indagine che discutono la morfologia comparativa delle isole di diverse specie. Il pancreas principale dei pesci è sia anatomicamente che evolutivamente simile al pancreas dei mammiferi, mentre importanti differenze sono evidenti in altre specie di pesci. Nel pesce zebra adulto, il pancreas principale contiene diversi isolotti principali circondati da tessuto esocrino. Una coda di isolotti singoli incorporati nel tessuto esocrino e nel grasso si estende caudalmente lungo l’intestino. Al contrario, le β-cellule della tilapia (un altro pesce teleosteo sensibile al glucosio) risiedono in isolotti di Langerhans situati lungo il mesentere che non sono circondati da tessuto esocrino. Rhamdia quelen è una specie di teleosteo ed è una specie importante per l’acquacoltura nei climi subtropicali. R. quelen si trova dal Messico meridionale all’Argentina centrale, e l’allevamento di questa specie si sta diffondendo verso il Brasile meridionale.
Nel presente studio analizziamo l’ultrastruttura delle isole di Langerhans e descriviamo in dettaglio i diversi tipi di cellule secretorie nel pesce gatto sudamericano R. quelen.
2. Materiali e Metodi
Quattro R. quelem di allevamento, due femmine e due maschi ( g; cm) provenienti dal Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) nella regione nord-orientale dell’Argentina e stoccati in vasche da 200 L dove sono stati acclimatati per due settimane prima della necroscopia. I pesci sono stati allevati con acqua dolce filtrata mantenuta a 25°C con un tasso di cambio dell’acqua del 100% al giorno. Il fotoperiodo è stato regolato a 12 ore di buio e 12 ore di luce. Sono stati alimentati a mano quattro volte al giorno con una dieta commerciale (Ganave). I pesci sono stati eutanasizzati con benzocaina (500 ppm) e necroscopizzati e campioni di grasso che si estende caudalmente lungo l’intestino sono stati fissati in formalina tamponata al 10%, inseriti in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina (H&E).
Piccoli frammenti di tessuto sono stati tagliati in blocchi da 1 mm e immediatamente fissati in glutaraldeide tampone fosfato (pH 6.9 a 4°C), lavati in soluzione di Millonig e postfissati in tetrossido di osmio all’1%; i blocchi di tessuto sono stati poi disidratati in una serie graduale di etanolo-acetone, immersi in ossido di propilene e incorporati in Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Svizzera). Sezioni sottili sono state tagliate con un ultramicrotomo LKB e doppia colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo prima dell’esame in un microscopio elettronico Jeol JEM-8T (Jeol, Tokyo, Giappone).
3. Risultati
3.1. Microscopia ottica
R. quelen hanno pancreas sparsi nel tessuto adiposo che circonda il dotto biliare comune; questo si trova all’interno di una regione approssimativamente triangolare delineata superiormente dallo stomaco, anteriormente dal fegato, e inferiormente dalla milza e cistifellea. Ogni isolotto di Langerhans è composto da tessuto isolato relativamente puro circondato da pancreas esocrino (Figura 1). Non sono state osservate differenze tra maschi e femmine.
3.2. Microscopia elettronica
Le cellule β, che di solito occupano l’interno degli isolotti, erano comunemente, ma non sempre, separate dal pancreas esocrino dalle cellule α situate perifericamente (Figura 2). L’aspetto ultrastrutturale delle β-cellule era identico nei campioni ottenuti dai quattro pesci. I distintivi β-granuli erano contenuti in sacchi lisci-membranati ed erano di forma e dimensioni variabili. Erano visibili cristalli rettangolari, quadrati, esagonali e irregolarmente poligonali. Forme rotonde erano presenti ma meno frequentemente (figure da 2 a 5). Ogni granulo consisteva di una o più forme cristalline o non strutturate di varie dimensioni e forma. La scelta del fissativo non sembra influenzare la struttura interna dei granuli β. Entro i confini della membrana avvolgente, l’area periferica ai cristalli appariva vuota o conteneva un sottile precipitato flocculante, indipendentemente dal fissativo usato. A maggiori ingrandimenti, una sottostruttura ripetitiva era talvolta visibile in quei cristalli correttamente orientati rispetto al piano della sezione (figure 6 e 7). I numerosi mitocondri erano dispersi in tutta la cellula e apparivano come strutture filamentose arrotondate o paffute. Erano più grandi e più numerosi di quelli della β-cellula, ma generalmente più piccoli di quelli delle cellule acinari pancreatiche. Le numerose criste mitocondriali erano, per la maggior parte, orientate trasversalmente, e i granuli mitocondriali erano presenti ma non prominenti. Le cisterne del reticolo endoplasmatico granulare erano solitamente corte o vescicolari (Figure da 2 a 4). Il reticolo endoplasmatico granulare e i ribosomi liberi non erano una caratteristica così prominente delle β-cellule come nelle cellule acinari o β. Quelle β-cellule con pochi granuli secretori erano normalmente più ricche di ribosomi e di reticolo endoplasmatico granulare, che era poi più frequentemente di configurazione cisternale (Figura 5).
Il complesso del Golgi era più prominente dopo la fissazione con aldeidi e le strutture componenti erano più dilatate (Figura 2). Dopo aver utilizzato questi fissativi, materiale amorfo denso era occasionalmente visibile all’interno delle vescicole del Golgi e può rappresentare granuli immaturi o precursori dei granuli β-secretori. I nuclei delle cellule β erano di solito sferici e relativamente lisci nei contorni. La membrana cellulare delle cellule isolate adiacenti era in stretta apposizione, anche se non frequentemente unita ai desmosomi. Alla giunzione di tre o più cellule, le membrane limitanti erano spesso convolute, con interdigitazioni tortuose delle cellule (Figure 2 e 9). Le inclusioni citoplasmatiche multivisulari simili a ceroidi erano cospicue nella maggior parte delle cellule β (Figure 2, 7, 9, e 8). L’aspetto e la frequenza di queste inclusioni non erano apprezzabilmente influenzati dall’uso primario di acido osmico o aldeide come fissativo, e non c’era alcuna relazione apparente tra la presenza di questi granuli e l’evidenza morfologica dell’attività fisiologica delle cellule. L’ultrastruttura delle cellule α era la stessa in tutti e quattro i campioni di tessuto. Le dimensioni e la forma di queste cellule e dei loro nuclei non erano significativamente diverse da quelle delle β-cellule normali (Figure 2 e 7). Anche se occasionalmente si trovava una α-cellula con un nucleo di forma irregolare o dentellato, questo non si verificava con sufficiente frequenza per servire come un utile criterio di differenziazione. I granuli citoplasmatici delle cellule α sono stati conservati dalla fissazione primaria con osmio come corpi densi e sferici di dimensioni variabili ed erano contenuti all’interno di sacche lisce-membranate (Figure 7 e 9). Erano più grandi dei granuli β, ma notevolmente più piccoli dei granuli zimogeni delle cellule acinari (Figura 2). I mitocondri sottili e allungati erano in numero moderato e più piccoli di quelli delle β-cellule e possedevano cristae solitamente orientate trasversalmente. Il reticolo endoplasmatico granulare era spesso di configurazione cisternale e più abbondante che nelle β-cellule (Figura 9). Il complesso di Golgi, quando visibile, era di proporzioni moderate. Materiali amorfi densi all’interno delle vescicole e delle cisterne del Golgi, presumibilmente i precursori dei granuli secretori, erano più comuni nelle cellule α che nelle cellule β (Figura 10). I corpi ceroidi, anche se frequentemente visibili, erano meno numerosi che nelle β-cellule (Figure 2 e 3). Le sacche in cui sono situati gli α-granuli sembravano, quindi, essere completamente riempite, e si è concluso che i granuli consistono in un nucleo denso interno arrotondato e un mantello esterno meno denso di elettroni che era assente dopo la fissazione dell’osmio (Figure 3 e 9) e quindi, forse, più solubile. Nessuna sottostruttura coerente era visibile all’interno o nelle porzioni periferiche degli α-granuli. In nessun momento sono state viste cellule che potrebbero essere interpretate come forme di transizione tra le α-cellule e le β-cellule. Gli α-granuli, comprese le porzioni esterne e interne più dense, erano paragonabili per dimensioni totali ai “δ-granuli”. Inoltre, sono presenti cellule intermedie che contenevano granuli di entrambi i tipi, suggerendo che le cellule δ erano in realtà cellule α modificate (Figura 10). Le cellule δ sono state visualizzate, anche se quasi sempre situate tra le cellule α, e sono state identificate e distinte ultrastrutturalmente dalle cellule α sulla base della minore densità elettronica e della maggiore dimensione complessiva dei loro granuli secretori. Inoltre, sono presenti cellule intermedie che contenevano granuli di entrambi i tipi, suggerendo che le cellule δ erano in realtà cellule α modificate (Figura 11).
Anche se esisteva una relazione inversa tra il numero di granuli secretori e la prominenza del complesso del Golgi e del reticolo endoplasmatico granulare, non è stato osservato alcun modello di rilascio di granuli α o β. Una sottile membrana basale e quantità variabili di tessuto connettivo di solito separavano gli isolotti pancreatici dalle cellule acinari adiacenti (Figura 2). Occasionalmente, tuttavia, nessuna membrana basale interveniva tra isolotti e cellule acinari che erano quindi separati solo dallo stretto spazio interstiziale. Le cellule endoteliali capillari fenestrate erano sempre separate da esse almeno dalla membrana basale capillare (Figura 9). A volte erano presenti anche altri elementi di supporto, tra cui collagene e componenti del tessuto elastico. Non sono state osservate differenze tra maschi e femmine.
4. Discussione
Le β-cellule dei pesci si distinguono facilmente dalle α-cellule per la morfologia dei granuli secretori. La frequente presenza di subunità angolari e l’apparente struttura ripetitiva suggeriscono una natura cristallina dei granuli β. I tentativi di risolvere e misurare le dimensioni di un reticolo cristallino non hanno ancora avuto successo. Quando i granuli secretori sono stati visualizzati nelle vicinanze del complesso del Golgi, le subunità cristalline non sono state generalmente osservate. Si è tentati di ipotizzare, quindi, che i granuli non cristallini o il materiale amorfo all’interno del complesso del Golgi rappresentino una forma chimica o fisica diversa dell’insulina o del complesso proteico dell’insulina rispetto alle subunità cristalline del granulo. Non è noto se queste diverse forme morfologiche all’interno dei β-granuli abbiano diverse solubilità e forse diversi modelli di rilascio in risposta alla domanda fisiologica. I granuli secretori non sono stati osservati nelle cisterne o nelle vescicole del reticolo endoplasmatico granulare. Si presume che, come per altre cellule secernenti proteine, il complesso del Golgi funzioni per concentrare o “confezionare” il prodotto sintetizzato nel reticolo endoplasmatico granulare. Ne seguirebbe logicamente che i sacchi a membrana liscia in cui sono contenuti i granuli secretori derivano dalle membrane del Golgi piuttosto che dal reticolo endoplasmatico granulare.
Le cellule α con i loro grandi, rotondi e densi granuli secretori sono abbastanza simili alle cellule α di altre specie. Anche se i granuli delle α-cellule variano ampiamente in dimensione, la maggior parte delle cellule sembra possedere un assortimento di granuli di dimensioni diverse, precludendo così una sottoclassificazione di questo tipo di cellule come è stato suggerito per altre specie. Al momento, non sono stati pubblicati dati fisiologici a sostegno dell’esistenza della “cellula δ” nell’isolotto pancreatico dei pesci. I vari protagonisti hanno sostenuto l’esistenza delle cellule δ con dati basati su esami al microscopio ottico di argento capriccioso, acido fosfotungstico-ematossilina, e altre macchie di granuli o studi al microscopio elettronico di tessuti mal conservati. Le micrografie qui presentate supportano l’opinione considerata da Bloom nel 1931 e successivamente da Gomori nel 1941 che le cellule δ potrebbero rappresentare cellule α modificate.
La transizione dal tipico α-granulo, con porzioni interne dense ed esterne meno dense, a un δ-granulo di circa le stesse dimensioni, con densità uniforme ma diminuita, è spesso accompagnata da una graduale perdita di integrità morfologica o di intensità di colorazione dei mitocondri, del complesso di Golgi e dei componenti membranosi del reticolo endoplasmatico granulare. I nuclei intatti e dall’aspetto vitale, così come la persistenza di un piccolo numero di ribosomi liberi e di corpi ceroidi, suggeriscono che le cosiddette cellule δ sono vitali anche nella presunta fase finale di questa transizione, cioè quando i granuli secretori stessi non sono più visibili e tutti gli organelli citoplasmatici diversi dai granuli ceroidi e dai ribosomi sono assenti. In mancanza di dati fisiologici che assegnino una funzione alle cellule δ e in assenza di prove morfologiche più convincenti per un tipo di cellula separata, si spera che la presentazione qui di una probabile transizione da cellule α a cellule δ sarà accettata come la spiegazione più probabile della terza cellula granulare di Bloom nell’uomo. Il significato di queste cellule α vitali ma alterate non è noto. Anche se le cellule α e β, singolarmente o in piccoli gruppi, possono essere viste all’interno degli acini e dei dotti, in nessuno dei quattro campioni pancreatici studiati sono state viste forme intermedie tra cellule acinari e isolotti o dotti e isolotti, come era stato suggerito da Nakamura e Yokote (4).
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non c’è nessun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimento
L. A. Romano ha ricevuto borse di ricerca sulla produttività dal Consiglio Brasiliano della Ricerca, CNPq (Processo n. PQ 301002/2012-6).
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