Introduzione

Come una polvere bianca, incolore e cristallina, il sodioazide (NaN3) è classificato come una sostanza altamente tossica. I suoi effetti tossici sono simili a quelli del cianuro, e ferisce il sistema cardiovascolare e thenervous, gli occhi e la pelle. Questo elemento tossico diventa attivo rapidamente dopo l’ingestione, e i suoi principali effetti si verificano diverse ore dopo l’assunzione orale, a seconda della quantità ingerita (1,2). L’esposizione a NaN3 può indurre una serie di sintomi in pochi minuti, tra cui nausea, vomito, mal di testa, irrequietezza, vertigini, debolezza, respiro rapido e battito cardiaco rapido (3). Quantità elevate di questo elemento tossico inducono immediatamente convulsioni, perdita di coscienza, bassa frequenza cardiaca e pressione sanguigna e insufficienza respiratoria, portando infine alla mortalità (3). Tra i meccanismi d’azione dimostrati di NaN3, il più rilevante è l’inibizione del complesso citocromoc ossidasi-catena respiratoria (4). Studi precedenti hanno rivelato che NaN3, un inibitore del complesso IV (Cox IV), può indurre apoptosi in neuroni corticali primari, che è caspasi-3 dipendente e associato con il rilascio di citocromo c (5).

Nella biosintesi mitocondriale, il promotore della catena respiratoria Cox IV può essere attivato da nucleare respiratoriafactors (Nrf)-1/2. Concomitantemente, Nrf può essere regolato regolando l’attività dei geni che codificano il fattore di trascrizione mitocondriale A (Tfam) per regolare indirettamente i livelli di espressione dei geni della catena respiratoria. Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) e altri co-attivatori costituiscono la cascata di segnali Pgc-1α, che ha un ruolo centrale in una rete di regolazione che governa il controllo trascrizionale della biogenesi mitocondriale e la funzione respiratoria. In questa cascata di segnali, Pgc-1α attiva prima Nrf-1/2 invece di legarsi direttamente al DNA mitocondriale, e Nrf-1/2 induce l’attivazione di Tfam in combinazione con il promotore di Tfam e innesca la trascrizione e la replicazione del DNA mitocondriale, portando ad un aumento dei livelli di espressione delle proteine mitocondriali (6). Contemporaneamente, Pgc-1α può essere attivata da CaN-, Ca2+/calmodulina-dipendente proteinasi (CaMK)-, protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK)- e vie di segnalazione mediate dalla chinina-dipendente (7). Nel presente studio, le cellule PC12 sono state utilizzate per generare un modello di neurone di dopamina, e gli effetti e il meccanismo di NaN3 sulle vie associate a Pgc-1α nelle cellule PC12 sono stati studiati, per identificare se NaN3 ha indotto la tossicità nelle cellule PC12 coltivate e i meccanismi sottostanti coinvolti in questi effetti.

Materiali e metodi

Materiali

Le cellule PC12 del feocromocitoma di ratto sono state acquistate dalla Cell Bank of Type Culture Collection della Chinese Academy ofSciences (Shanghai, Cina). Soluzione stock di NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania) è stato sciolto nella soluzione salina sterile per fare una soluzione stock 1 M, che è stato successivamente diluito a concentrazioni desiderate prima della sperimentazione. Un kit one-step TUNEL Apoptosis Assay (C1090), Annexin V-fluoresceina isotiocianato (FITC) Apoptosis Detection kit (C1063), Enhanced adenosina 5′-trifosfato (ATP) Assay kit (S0027), JC-1 Potenziale di membrana mitocondriale kit (C2006) e Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) sono stati forniti da Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Cina).

Cultura cellulare e test di vitalità

Le cellule PC12 sono state mantenute in Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) e 1% di soluzione antibiotica antimicotica composta da 10.000 U di penicillina e 10.000 U di streptomicina. Le cellule sono state incubate a 37 ° C in atmosfera umidificata del 5% di CO2 e sempre utilizzato a70-80% confluenza.

La vitalità delle cellule PC12 è stata determinata utilizzando unCell Counting Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, Cina). Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 1×105/well. Dopo 24 ore di cultura, le cellule sono state trattate con NaN3 (0-80 mM) e incubate per 12, 24, 48 e 72 ore per stabilire il modello di lesione cellulare. Successivamente, 10 µl di soluzioneCCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e incubati per altre 2 ore nelle condizioni standard (37°C e 5% CO2). L’assorbanza alla lunghezza d’onda di 450 nm è stata determinata da ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). La vitalità cellulare è stata calcolata in base alla densità ottica media di 6 pozzetti. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. Le concentrazioni appropriate di NaN3 per l’uso in esperimenti successivi sono state determinate in base ai risultati dei saggi di cellviability.

Morfologia nucleare delle cellule PC12 colorate con DAPI

Le cellule PC12 sono state esposte a 0, 10, 20 e 40 mMNaN3 per 24 ore. Per distinguere la morte cellulare programmata da quella non apoptotica, i nuclei sono stati colorati con 10 µg/ml di DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Brevemente, le cellule sono state lavate due volte con PBS e poi fissate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo tre lavaggi, le cellule fissate sono state colorate con DAPI (1:5,000) per 5 minuti e poi lavate con PBS. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite con un microscopio a fluorescenza Leica DMI (ingrandimento, ×400).

Misurazione del tasso apoptotico

Un kit Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection (Beyotime Institute of Biotechnology) è stato utilizzato per determinare apoptosi delle cellule secondo le istruzioni del produttore: I tassi apoptotici delle cellule PC12 di controllo (0 mMNaN3) e delle cellule PC12 esposte a 10, 20 e 40 mMNaN3 per 24 ore sono stati misurati mediante citometria a flusso (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Le analisi statistiche sono state condotte con il software statistico SPSS v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

Misurazione del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm)

ΔΨm è un parametro significativo del funzionamento dei mitocondri. È stato valutato usando la colorazione con JC-1, una sonda fluorescente. Gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato e sono stati eseguiti come segue: Le cellule PC12 di controllo sono state trattate con 0 mMNaN3; e le cellule PC12 sperimentali sono state esposte a 10, 20 e 40 mM NaN3 per 24 ore. Successivamente, secondo il protocollo del produttore (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), le cellule sono state incubate con il mezzo contenente JC-1 (1X) a 37°C per 20 minuti, le cellule sono state lavate tre volte con tampone di lavaggio e raccolte con mezzo fresco senza siero. Contemporaneamente, il controllo positivo è stato trattato con cianuro di carbonile 3-clorofenilidrazone (CCCP), un inibitore, (10 µM) a 37°C per 20 minuti. Poi, la fluorescenza rosso/verde è stata determinata mediante FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). I rapporti tra l’intensità della fluorescenza rossa e quella della fluorescenza verde rappresentavano i livelli di ΔΨm.

Misurazione della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)

I ROS nelle cellule PC12 sono stati valutati usando un kit di saggio delle specie reattive dell’ossigeno (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Cina). Intracellulare generazione ROS è stato valutato per mezzo di 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA), una sonda fluorescente. Intracellulare ROS ossida DCFH-DA, producendo il composto fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina (DCF), e l’intensità della fluorescenza DCF è considerata parallela alla quantità di ROS formato, secondo le istruzioni del kit di dosaggio ROS.Gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato ed eseguiti come segue: il controllo positivo è stato trattato con una concentrazione specifica di Rosup (50 mg/ml); le cellule PC12 di controllo sono state trattate con 0 mMNaN3; e le cellule PC12 sperimentali sono state esposte a 10, 20 e 40 mM NaN3 per 24 ore. Inoltre, le cellule PC12 sono state trattate con DCFH-DA (10 mM) sciolto in DMEM senza siero (1:1,000) per 20 minuti a 37°C e poi lavate tre volte con DMEM senza siero. Il controllo positivo è stato trattato con Rosup, per indurre la produzione di ROS. La produzione di ROS è stata determinata da FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). L’intensità media di fluorescenza (MFI) ha rappresentato i livelli di ROS.

Misurazione del contenuto cellulare di ATP in cellule PC12

Gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato ed eseguiti come segue: Le cellule PC12 di controllo sono state trattate con 0 mMNaN3; e le cellule PC12 sperimentali sono state esposte aNaN3 a diverse concentrazioni (10, 20 e 40 mM) per 24 ore. Successivamente, il contenuto cellulare di ATP è stato determinato utilizzando un kit di analisi della luciferasi ATP (Beyotime Institute ofBiotechnology) secondo il protocollo del produttore.

Analisi western blot

Le cellule PC12 sono state esposte a 0, 10, 20 e 40 mMNaN3 per 24 ore, lisate in tampone di radioimmunoprecipitazione assaylysis (Beyotime Institute of Biotechnology) contenente inibitore dell’aproteasi e centrifugate a 13,362 × g per 10 min a 4°Cper raccogliere i surnatanti. Successivamente, le concentrazioni di proteine sono state determinate utilizzando il kit BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Quantità uguali di proteine (90 µg) sono state sottoposte a 10 e 12% SDS-PAGE, e poi trasferite su membrane di polivinilidenefluoruro (0.45 µm) usando una Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Dopo il blocco con il 5% di sieroalbumina bovina in TBS contenente 0.1% Tween-20 (TBST) per 2 h a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate con anticorpi primari contro Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1,000), Tfam (Abcam; 1:1,000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurina A (CaN; Cell Signaling Technology Inc.; 1:1.000), fosforilato (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1.000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.1:1.000), p-extracellular signal-regulated kinase (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-associated X protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc, Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) e citocromo c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) a 4°C durante la notte. Le membrane sono state poi lavate con TBST e incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di cavallo (HRP) (coniglio; cat. no. A0208; 1:1,000; o topo; cat. no. A0216; 1:1,000; entrambi Beyotime Instituteof Biotechnology) per 1 ora a temperatura ambiente. Bande immunoreattive sono stati visualizzati dal sistema di chemiluminescenza avanzata (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina) e quantitativamente analizzati con Image J versione l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), e β-actina è stato selezionato come il controllo di carico.

Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state condotte con SPSSstatistical software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). I dati sono espressi come media ± deviazione standard errore standard della media. La significatività statistica delle differenze tra i gruppi è stata determinata dall’analisi della varianza a una via seguita da test di Bonferroni post-hoc. P<0.05 è stato considerato per indicare una differenza statisticamente significativa. Ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte.

Risultati

NaN3 inibisce la crescita delle cellule PC12

L’effetto dell’esposizione a NaN3 sulla proliferazione delle cellule PC12 è stato valutato dal saggio CCK-8. Le cellule sono state sottoposte a diverse concentrazioni (0-80 mM) di NaNaN3 per 12-72 ore. La Tabella I e le Fig. 1A-D indicano che la vitalità delle cellule è diminuita da NaN3 in modo dipendente dalla concentrazione. Quasi il 100% delle cellule sono morte dopo l’esposizione a 80 mM NaN3 per 72 ore, indicando che NaN3 ha indotto marcatamente la morte cellulare, e la citotossicità di NaN3 è stata rilevata in modo dose e tempo-dipendente. L’esposizione a NaN3 ad una concentrazione di 20 mM per 24 ore ha causato una marcata morte cellulare nelle cellulePC12 (50%). Pertanto, le cellule coltivate per 24 h sono state utilizzate per gli esperimenti successivi.

Morfologia cellulare

Nella colorazione DAPI, i cambiamenti morfologici delle cellule PC12 sono stati osservati al microscopio a fluorescenza dopo l’esposizione a diverse concentrazioni di NaN3. È stata osservata la frammentazione dei nuclei cellulari esposti a NaN3 per 24 ore, e il restringimento dei nuclei cellulari e la condensazione della cromatina sono stati leggermente aumentati con la concentrazione di NaN3 nelle cellule PC12 rispetto al controllo. In queste cellule, le cellule apoptotiche erano più piccole e più luminose rispetto alle cellule normali. Inoltre, il numero di cellule apoptotiche e l’intensità della fluorescenza verde erano aumentati nelle cellule esposte a NaN3 (Fig. 2).

Determinazione del tasso apoptotico mediante colorazione Annexin V-FITC

Le cellule morte o le cellule apoptotiche tardive che hanno perso l’integrità della membrana cellulare possono essere colorate con ioduro di propidio. A causa della perdita di questa integrità della membrana cellulare, l’Annexin V-FITC può entrare nel citoplasma e combinarsi con la fosfatidilserina all’interno della membrana cellulare, mostrando una fluorescenza verde nelle cellule morte. La Fig. 3 dimostra che il numero di cellule apoptotiche era 5,03, 8,02, 43,77 e 78,67% (P<0,05) nelle cellule PC12 dopo l’esposizione a NaN3 a diverse concentrazioni (0, 10, 20 e 40 mM) per 24 ore, rispettivamente. Questi risultati hanno inoltre confermato che NaN3 ha indotto l’apoptosi cellulare in modo dose-dipendente.

Cambiamenti nel potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm)

Gli mitocondri sono generalmente considerati organi di regolazione chiave coinvolti nella vitalità cellulare. Pertanto, il ΔΨm è stato usato come indicatore della funzione mitocondriale. Le cellule PC12 sono state colorate con JC-1, un colorante cationico che mostra un accumulo potenziale-dipendente nei mitocondri. La fluorescenza rossa (aggregati J), che rappresenta mitocondri attivi con potenziale di membrana stabile, è stata osservata in un piccolo numero di cellule esposte a concentrazioni crescenti di NaN3. Al contrario, la fluorescenza verde (J-monomero), che rappresenta mitocondri apoptotici con ΔΨm danneggiato, è stata osservata in un certo numero di cellule. Il rapporto di fluorescenza rossa e verde è diminuito gradualmente nel gruppo di controllo (Fig. 4).

Accumulo di ROS mitocondriale indotto da NaN3

È noto che i mitocondri sono la fonte primaria di ROS cellulari, e i ROS hanno un ruolo importante nell’inattivazione della segnalazione apoptotica. Pertanto, il ruolo dei ROS nella morte cellulare PC12 indotta da NaN3 è stato ulteriormente indagato. La Fig. 5 indica che le intensità di fluorescenza nelle cellule di controllo e nelle cellule esposte a NaN3 a varie concentrazioni (0, 10, 20 e 40 mM) per 24 ore erano 3,65, 6,99, 18,63 e 39.35, rispettivamente, indicando che l’esposizione a NaN3 ha aumentato significativamente la produzione di ROS mitocondriali rispetto al gruppo di controllo (P<0.05). Questi risultati hanno suggerito che l’apoptosi indotta da NaN3 ha migliorato la produzione di ROS intracellulari.

NaN3 downregulates themitochondrial energy production of cellular ATP

To evaluate the ATP content in PC12 cells exposed toNaN3, the relative luminescence unit (RLU) wasquantitatively determined by a luminometer. La Fig. 6 indica che NaN3 ha inibito la produzione mitocondriale di ATP e ha gradualmente diminuito il livello di ATP cellulare (P<0.05).

Livelli di espressione di Pgc-1α e proteine associate all’apoptosi nelle cellule PC12

L’espressione di Pgc-1α a livello proteico era significativamente diminuita dopo l’esposizione a NaN3 rispetto al controllo (P<0.05). Inoltre, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 e Cox IV sono ben noti obiettivi a valle della dinamica di Pgc-1α in vari tipi di cellule (8). Il presente studio ha identificato che l’esposizione a NaN3 ha inibito significativamente la dinamica di Pgc-1α in modo dose-dipendente (P<0.01; Fig. 7A).

Inoltre, l’esposizione a NaN3 ha aumentato i livelli di espressione di Bax e citocromo c, mentre ha diminuito i livelli di espressione di Bcl-2 e procaspase-3 (P<0.05). Il rapporto di Bax/Bcl-2 era anche significativamente aumentato rispetto al gruppo di controllo (P<0.05; Fig. 7B).

I livelli di espressione proteica di altri membri importanti, tra cui CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK e p-p38 MAPK, sono stati valutati anche. I risultati hanno indicato che NaN3 ha aumentato l’espressione di CaN e la fosforilazione di CaMKII e p38 MAPK rispetto al gruppo di controllo, mentre i livelli di espressione di CaMKII totale e p38 MAPK non sono cambiati. Inoltre, i rapporti di p-CaMKII/CaMKII e p-p38/p38 MAPK nel gruppo NaN3 erano significativamente aumentati rispetto a quelli del gruppo di controllo (P<0.01; Fig. 7C).

Discussione

Per determinare se NaN3 ha inibito la proliferazione delle cellule PC12, il numero di cellule trattate in fase logaritmica è stato confrontato con il numero di cellule non trattate di controllo. La crescita delle cellule è stata inibita di ~75% dopo 24 ore di esposizione a 20 mM NaN3. Pertanto, questa concentrazione è stata utilizzata per i successivi esperimenti. L’apoptosi comporta cambiamenti incellulari morfologia, tra cui membrana blebbing, restringimento cellulare, condensazione della cromatina, frammentazione nucleare e frammentazione del DNA (9). Per analizzare ulteriormente la morfologia nucleare dell’apoptosi e il tasso apoptotico, le cellule sono state sottoposte a 0, 10, 20 e 40 mM NaN3 per 24 ore. Dopo il trattamento, le cellule sono state colorate con DAPI e AnnexinV-FITC/PI e la distribuzione dei nuclei è stata analizzata. I risultati hanno confermato che l’esposizione a NaN3 ha indotto l’apoptosi nelle cellule PC12 in modo concentrazione-dipendente.

I mitocondri sono coinvolti in numerose funzioni metaboliche, tra cui il mantenimento del pH intracellulare e la produzione di ROS, che promuovono e regolano l’apoptosi cellulare (10). Le caratteristiche dell’apoptosi cellulare sono precedute da alterazioni mitocondriali, tra cui una perdita di ΔΨm, una diminuzione della produzione di energia (ATP) e un aumento della permeabilità della membrana mitocondriale. Studi precedenti hanno suggerito che le rose innescano danni alla catena respiratoria mitocondriale e inducono la perdita di ΔΨm, che sono i fattori che mediano o amplificano la disfunzione neuronale nel corso della neurodegenerazione, portando di conseguenza allo sviluppo di malattie neurodegenerative (11,12).NaN3 è noto per guidare la degenerazione e l’eccitotossicità aumentando il potenziale di permeabilità della membrana mitocondriale attraverso la perossidazione lipidica (13-15), e NaN3 esercita la sua azione tossica primaria inibendo la funzione del citocromo ossidasi nella catena mitocondriale electrontransport e impedendo la produzione di ATP (4). Nel presente studio, la FCM è stata usata per identificare il ΔΨm e la produzione di ROS nelle cellule PC12. Inoltre, è stata esaminata la sintesi di ATP nei mitocondri dopo l’esposizione a varie concentrazioni di NaN3. La rottura della membrana plasmatica, l’aumento della produzione di ROS mitocondriale e la diminuzione del contenuto di ATP cellulare osservati hanno suggerito che l’esposizione a NaN3 ha indotto l’apoptosi nelle cellule PC12.

La morte cellulare mitocondriale può essere attivata da molteplici stimoli, tra cui il programma di sviluppo, il danno al DNA, lo stress del reticolo endoplasmatico, il fattore di crescita e la deprivazione di nutrienti, l’infezione virale e lo stress ossidativo (16). Come membro della sempre crescente famiglia di co-regolatori nucleari, Pgc-1α può attivare un ampio set di geni e regolare i livelli di espressione dei geni coinvolti nel metabolismo energetico in risposta alle vie di segnalazione che mediano la termogenesi, la gluconeogenesi, la commutazione del tipo di fibra muscolare e la biogenesi mitocondriale (17).Questi co-regolatori esistono e funzionano in grandi complessi multi-proteici, in cui piuttosto che legarsi al DNA, regolano Nrf-1/2 e Tfam e modulare la loro potenza trascrizionale promuovendo le successive interazioni biochimiche necessarie per l’induzione o la repressione della trascrizione del gene (8). Inoltre, Nrf-1/2 controlla anche indirettamente l’espressione dei geni codificati dal DNA mitocondriale inducendo potentemente il Tfam A, B1 e B2 codificati dal nucleare (Tfam, Tfb1m e Tfb2m, rispettivamente), che sono i regolatori della trascrizione e replicazione del genoma mitocondriale (18). Studi precedenti hanno dimostrato che NaN3 è un inibitore del complesso IV della catena respiratoria mitocondriale, che è frequentemente colpito nei disturbi mitocondriali primari (19,20). Nel presente studio, l’espressione della cascata di segnali Pgc-1α, comprese le proteine della famiglia Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 e Tfam) e Cox IV, è stata prima esaminata nelle cellule PC12 per verificare se gli eventi di segnalazione fossero coinvolti nell’apoptosi indotta da NaN3. I risultati hanno suggerito che l’apoptosi indotta da NaN3 era associata ai livelli di espressione delle proteine della famiglia Pgc-1α e Cox IV nella via di segnalazione mediata dai mitocondri. Quando le concentrazioni di NaN3 sono state aumentate, i livelli di espressione di queste proteine sono stati significativamente diminuiti, indicando che possono essere coinvolti nell’attivazione e nello sviluppo dell’apoptosi.

Inversamente, il complesso IV può innescare l’apoptosi nei neuroni corticali primari, che è caspasi3-dipendente e associata al rilascio di citocromo c (5). È noto che i mitocondri sono regolatori chiave dell’apoptosi cellulare. Le proteine della famiglia Bcl-2 sono gli importanti iniziatori della via apoptotica mitocondriale. Questa famiglia include le proteine pro-apoptotiche Bax, Bcl-2 omologoantagonista/killer e Bcl-2-associato agonista della morte cellulare e le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-extra large (Bcl-xL). Nelle cellule sane, Bax è una proteina citosolica inattiva, ma viene trasferita nei mitocondri durante l’apoptosi. Esercita i suoi effetti pro-apoptotici formando un poro nell’outermembrana mitocondriale, attraverso il quale il citocromo c viene rilasciato nel citoplasma, portando all’attivazione della caspasi 3 (21). Le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-xL sopprimono la funzione di Bax mantenendo l’integrità della membrana mitocondriale, che impedisce il rilascio del citocromo c all’attivazione della caspasi 3 (22). Nel presente studio, NaN3 ha aumentato i livelli di Bax pro-apoptotico e di citocromo c e ha diminuito i livelli di Bcl-2 anti-apoptotico e di caspasi-3, indicando che NaN3 ha iniziato la segnalazione di apoptosi mitocondriale nelle cellule PC12.

Inoltre, i livelli di espressione dei co-attivatori Pgc-1α sono altamente inducibili a livello trascrizionale attraverso una varietà di vie di segnalazione a monte. Per esempio, l’espressione di Pgc-1α è indotta dall’esercizio fisico e dall’esposizione al freddo sotto il controllo della segnalazione dello stress attraverso il Ca2+ cellulare e la segnalazione dell’adenosina 5′-monophosphate (cAMP) (23). La trascrizione di Pgc-1α può essere influenzata da CaMK, calcineurina, recettore β-adrenergico/cAMP e p38MAPK (24-26). Inoltre, la p38 MAPK, appartenente alla famiglia delle MAPK, ha una funzione fondamentale nella proliferazione, differenziazione, trasformazione e apoptosi delle cellule, poiché l’attivazione dell’apoptosi può indurre la Pgc-1α attraverso la fosforilazione diretta (27). Nel presente studio, i livelli di espressione delle proteine nelle vie di segnalazione del Ca2+ (pan-calcineurina A e p-CaMKII/CaMKII) e p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK e p-Erk1/2) sono stati esaminati per indagare gli effetti di NaN3 sull’omeostasi intracellulare del Ca2+ e p38 MAPK. I dati hanno indicato che i livelli proteici della pan-calcineurina A, e i rapporti p-CaMKII/CaMKII e p-p38MAPK/p38 MAPK sono aumentati e il livello p-Erk1/2 è diminuito nel gruppo trattato con NaN3, suggerendo che NaN3 ha innescato l’apoptosi delle cellule PC12 in modo adose-dipendente, e tale attivazione è stata associata alle vie Ca2+ e p38 MAPK. Nel complesso, questi risultati sperimentali hanno confermato che NaN3 può indurre l’apoptosi delle cellule PC12 attivando Ca2+ e p38 MAPKpathways. Al meglio delle nostre conoscenze, il presente studio ha rivelato per la prima volta che NaN3 induce l’apoptosi mediata dai mitocondri nelle cellule PC12 attraverso le vie di segnalazione associate a Pgc-1α, compresi Ca2+/p-CaMKII e p38 MAPK.

In sintesi, il presente studio ha dimostrato che NaN3 può indurre l’apoptosi delle cellule PC12. Al fine di chiarire il meccanismo tossico sottostante all’esposizione a NaN3, sono stati esaminati i livelli di espressione di una serie di proteine pro-apoptotiche (Bax e citocromo c) e anti-apoptotiche (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII e Pgc-1α). I risultati hanno confermato che le proteine pro-apoptotiche hanno esercitato effetti pro-apoptotici sulle cellule PC12 attraverso l’attivazione e la fosforilazione di CaMKII e p38 MAPK, che hanno stimolato l’attivazione di Pgc-1α e procaspase-3 nelle cellule PC12. I dati forniscono una base per studi successivi che indagano i meccanismi d’azione di NaN3 a livello molecolare. Studi futuri possono includere l’aggiunta di agenti protettivi, per esempio l’inibitore della divisione mitocondriale 1, un derivato del chinazolinone che è un inibitore della divisione mitocondriale di recente identificazione, prima del trattamento con NaN3, al fine di indagare gli effetti neuroprotettivi dell’agente protettivo nell’attenuazione dell’apoptosi indotta da NaN3 nelle cellule PC12, e per chiarire ulteriormente il meccanismo sottostante.

Acknowledgements

Non applicabile.

Finanziamento

Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente da thegrants dal National Natural Science Foundation of China (grantno. 81571848) e il Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Disponibilità di dati e materiali

I set di dati utilizzati o analizzati durante il presente studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta ragionevole.

Contributi degli autori

YZ e SZ concepito e progettato lo studio. YZ, JH,HX, TG e YW hanno acquisito i dati. YZ, JH e HX hanno analizzato e interpretato i dati e redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno rivisto criticamente il manoscritto, e letto e approvato la versione finale del manoscritto.

Approvazione etica e consenso toparticipate

Non applicabile.

Consenso del paziente per la pubblicazione

Non applicabile.

Interessi concorrenti

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Glossario

Abbreviazioni

Abbreviazioni:

NaN3	sodio azide
Cox IV	complex IV
Tfam	fattore di trascrizione mitocondriale A
Nrf-1/2	fattore respiratorio nucleare-1/2
CaN	pan-calcineurina A
Pgc-1α	coattivatore 1- del recettore attivato dal proliferatore del perossisomaα
PC12	fecromocitoma di ratto
ΔΨm	potenziale di membrana mitocondriale
CCCP	cianuro di carbonio3-clorofenilidrazone
ROS	specie reattive dell’ossigeno
FCM	citometria di flusso
MAPK	mitogen-protein chinasi attivata

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