Studi di ricerca

Nei nostri studi, abbiamo esaminato una coltura dell’UE, Pisum sativum (pisello). I piselli sono suscettibili a un’ampia gamma di virus, tra cui il virus del mosaico dell’enazione del pisello, il virus dell’imbrunimento precoce del pisello e una serie di virus del gruppo Y del virus della patata (Potyviridae). All’interno di quest’ultimo gruppo, il Bean yellow mosaic virus, il Bean common mosaic virus, il Pea mosaic virus e il Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) sono tutti importanti patogeni. In particolare, abbiamo studiato il PSbMV per il quale tutte le cultivar commerciali di piselli sono suscettibili. Questa suscettibilità è aggravata dal fatto che questo virus non solo è trasmesso da pianta a pianta dal suo afide vettore, ma è anche trasmesso verticalmente di generazione in generazione nel seme. Questa proprietà ha portato a una grave contaminazione delle collezioni di germoplasma di piselli e fornisce un mezzo molto efficace per dare un’infezione precoce e diffusa delle colture subito dopo la germinazione dei semi. Si consideri che un’efficienza di trasmissione dei semi di solo 0,1% si tradurrebbe in 10.000 infezioni dopo la semina di semi a 107/ettaro, e l’importanza della trasmissione dei semi diventa evidente. Attualmente, questo problema è contrastato da un efficiente controllo post-raccolta dei campioni di semi tramite immunodetection della proteina del mantello del virus, e dal rifiuto dei lotti di semi contaminati. Come alternativa, e dato che la trasmissione del seme in una gamma di cultivar di piselli varia da 0 a 100%, abbiamo studiato se la resistenza alla trasmissione del seme potrebbe essere allevata in linee di piselli migliorate. Negli incroci di prova e nei reincroci tra linee che non mostrano alcuna trasmissione o una trasmissione del 60-80%, la resistenza si è comportata come un carattere dominante, anche se nelle generazioni F2 e BC2 non si è segregata come un tratto mendeliano. La natura quantitativa del fenotipo ha suggerito che la trasmissione del seme sarebbe difficile da includere come tratto di resistenza in un programma di allevamento convenzionale.

La resistenza naturale al PSbMV è stata identificata in accessioni di pisello dal Nord Africa e dall’Asia anche se, finora, questi geni recessivi non sono stati introdotti in linee commerciali. L’analisi genetica ha dimostrato che questi geni sono raggruppati con altri geni recessivi con diverse specificità del virus poty in due punti del genoma del pisello. I geni sbm-1, sbm-3 e sbm-4, che conferiscono resistenza ai patotipi PI, L-l e P4 di PSbMV, rispettivamente, si trovano sul cromosoma 6, mentre sbm-2, che conferisce resistenza al patotipo L-l, si trova sul cromosoma 2. Anche se questa organizzazione è suggestiva della conversione genica locale e della traslocazione tra i cromosomi 2 e 6, altre prove suggeriscono che i due gruppi di geni possono avere origine e funzione distinte. Utilizzando virus ibridi ricombinanti realizzati tra diversi patotipi, il determinante di avirulenza del virus è stato definito come la proteina genomelinked del virus (VPg) per sbm-1 . Un’analisi strutturale e funzionale del gene sbm-1 è l’argomento di un progetto EC-Biotechnology # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) che coinvolge gruppi di ricerca e industrie di Danimarca, Finlandia, Spagna e Regno Unito.

La caratterizzazione del gene sbm-1 fornirà particolari ricompense intellettuali e pratiche. Poiché circa il 20% di tutti i geni di resistenza ai virus e circa il 40% dei geni che conferiscono resistenza ai potyvirus sono recessivi, capire come funziona sbm-1 e cosa controlla la specificità dei geni di resistenza sbm- e di altri potyvirus adiacenti sarà importante per un’ampia gamma di malattie. Tuttavia, il progetto sbm- ha anche delle sfide tecniche, non ultima quella di dover affrontare le dimensioni e la ridondanza all’interno del genoma del pisello. Il genoma del pisello è di circa 5 x 109 paia di basi per genoma aploide, circa 50 volte più grande di quello dell’Arabidopsis thaliana. Il clonaggio dei geni del pisello basato sulla mappa non è stato realizzato e non sono ancora disponibili grandi librerie di inserti. Tuttavia, c’è il potenziale in sbm-1 per identificare una nuova classe di geni di resistenza. I geni di resistenza clonati finora da altre specie rientrano in due classi. I geni di resistenza dominanti che funzionano contro specifici virus, funghi e batteri rientrano ampiamente nella classe “NBS-LRR” e mediano una resistenza ipersensibile all’infezione. L’unico gene recessivo che è stato clonato (mlo) media una resistenza non specifica della razza all’oidio dell’orzo ed è anche associato alla localizzazione del patogeno nelle cellule morte. Funzionalmente, Mlo agisce come regolatore negativo della resistenza costitutiva. Al contrario, sbm-1 è specifico della razza (o del patotipo) e non è associato alla morte cellulare. Da questi confronti, diversi meccanismi funzionali per sbm-1 sembrano possibili. In primo luogo, possiamo vedere Sbm-1 come un fattore di suscettibilità dominante, richiesto per assistere la replicazione del virus. Questo si adatta al probabile coinvolgimento del VPg nella replicazione dell’RNA virale e all’osservazione che i protoplasti di piante resistenti non mostrano alcuna replicazione virale rilevabile. In secondo luogo, come Mlo, Sbm-1 potrebbe agire come regolatore negativo della resistenza, sebbene le differenze di specificità rispetto a Mlo collocherebbero Sbm-1 in una classe distinta di geni di resistenza. In terzo luogo, sbm-1 potrebbe essere un allele di resistenza debole dominante ma dose-dipendente. Noi preferiamo la prima opzione come l’interpretazione più diretta e semplice.

Per la nostra componente nel progetto EC-Biotechnology abbiamo scelto di usare approcci genetici per identificare il prodotto del gene di resistenza sbm-1. Dopo aver identificato le linee di pisello adatte (una coppia di linee BC4 portatrici di alleli omozigoti di resistenza e suscettibilità) è stata utilizzata una strategia cDNA-AFLP per identificare i geni espressi provenienti dalla regione introdotta. Finora sono stati identificati dieci cDNA polimorfici. Questi sono stati mappati usando famiglie inbred ricombinanti per confermare la loro origine genomica. La nostra strategia alternativa è quella di “pescare” il prodotto del gene sbm-1 utilizzando il sistema yeast two-hybrid con il PSbMV VPg come proteina esca. Due forti cDNA candidati e altri otto cDNA che codificano proteine interagenti sono stati identificati da una libreria di cDNA di pisello fatta da una linea di pisello suscettibile. Questi cDNA sono stati anche sequenziati e mappati.

Come parte di un precedente progetto EC-AIR (# CT94-1171) che ha coinvolto partner accademici e industriali in Danimarca, Francia e Regno Unito, abbiamo anche esplorato il potenziale per sviluppare la PDR al PSbMV nei piselli transgenici. Poiché in altri sistemi il gene della replicasi virale era stato comunemente usato per dare PDR innescando il processo di silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS), abbiamo usato il cistrone della replicasi PSbMV (NIb) per l’espressione transgenica nei piselli . Da 35 linee di piselli, trasformati con Agrobacterium tumefaciens T- DNA che porta un promotore 35S -Nib – 35S terminatore costrutto, e il gene bar come un marcatore selettivo per il tessuto trasformato in presenza del diserbante Bialophos, tre linee si sono dimostrate resistenti a PSbMV. Due di queste linee portavano una ripetizione diretta dell’estremità 3′ del gene Nib (NIbIb) poiché c’era qualche prova che le disposizioni complesse del transgene avevano più potenziale per iniziare la PTGS. Tutte queste linee hanno esibito un tipo di PDR chiamato “recupero” in cui l’inoculazione della sfida provoca un’infezione iniziale ma le piante si riprendono rapidamente e non mostrano più sintomi o accumulo di virus. I tessuti recuperati sono poi resistenti a ulteriori sfide con virus omologhi o isolati strettamente correlati. Per valutare l’importanza di ciò nel campo dove le piante possono essere sfidate con una popolazione di virus correlati, è stata valutata la capacità di diversi isolati di PSbMV di innescare la PTGS e di essere bersagliati dalla PTGS indotta. Questo ha mostrato che i virus con circa l’89% o più di identità nel cistron NIb potrebbero indurre la resistenza anche se i requisiti di specificità per un secondo virus di sfida per essere visto come un bersaglio possono essere più alti. Per riferimento, i due isolati PSbMV sequenziati più divergenti differiscono dell’89% nella regione Nib. Questa distinzione nei requisiti di specificità per l’innesco e il targeting in PTGS sarà una considerazione importante per l’applicazione della tecnologia alle colture commerciali. La resistenza relativamente ampia agli isolati di PSbMV nei piselli transgenici Nib contrasta con l’estrema specificità del patotipo vista per i geni naturali di resistenza sbm, dove solo uno o pochi cambiamenti nel determinante di avirulenza del virus sono sufficienti a cambiare un isolato di PSbMV da avirulento a virulento.

Nonostante il breve periodo di infezione iniziale, le piante di pisello transgeniche hanno mostrato una buona crescita e l’allegagione dei semi dopo l’inoculazione della sfida per dare rese in condizioni di serra equivalenti a quelle viste per linee transgeniche o non transgeniche non infette. Riteniamo che, in base agli accordi di licenza che coprono l’uso del gene bar per la selezione delle piante trasformate, queste piante potrebbero essere utili aggiunte al pannello di geni di resistenza ai patogeni da utilizzare nello sviluppo di nuove linee migliorate di piselli.

Le piante transgeniche di pisello rappresentano i primi legumi che mostrano PDR contro i potyvirus e alcuni dei primi esempi sperimentali nelle Leguminose di piante che mostrano PTGS. Era prezioso, quindi, stabilire che i principi che governano la PTGS e la resistenza in questo sistema supportassero quelli caratterizzati con piante sperimentali più comunemente usate (per esempio Nicotiana spp.). Come previsto per la PTGS, la resistenza virale indotta era associata alla degradazione dell’RNA del transgene e dell’RNA del PSbMV. Abbiamo anche dimostrato che la PTGS era mediata in queste piante da un segnale sistemico generato durante la fase iniziale dell’infezione del virus, e che questo segnale aveva il potenziale di mediare la diffusione della PTGS inducendo la metilazione nella regione trascritta del transgene NIb .

In conclusione, abbiamo riconosciuto che l’industria agricola beneficerebbe di avere una resistenza stabile ed efficace al PSbMV nei piselli. La via meno controversa per raggiungere questo obiettivo sarebbe l’incorporazione di resistenze naturali (sia alla trasmissione dei semi che alla replicazione del virus) utilizzando strategie di allevamento convenzionali. La nostra comprensione relativamente scarsa della complessità genetica della trasmissione dei semi di PSbMV significa che è improbabile che ciò sia utile a breve termine. I geni sbm- sono più promettenti anche se la mancanza di marcatori genetici strettamente collegati e la natura recessiva della resistenza creano alcune difficoltà. In alternativa, abbiamo dimostrato il potenziale per la creazione di resistenza attraverso l’applicazione della tecnologia transgenica, anche se le questioni di biosicurezza e accettabilità pubblica dovranno essere affrontate. Oltre a queste considerazioni applicate, la ricerca ha e sta generando materiali e conoscenze che influenzeranno il modo in cui gli approcci correlati possono essere utilizzati in altre piante coltivate. In particolare, la comprensione dei meccanismi d’azione di una nuova classe di geni di resistenza ai virus sarà importante.