Discussione

Il presente studio ha identificato una serie di caratteristiche distinte di EC e SMC collaterali che possono essere alla base o contribuire alle caratteristiche uniche dei collaterali descritte nell’introduzione. Abbiamo trovato che nonostante il basso e oscillatorio shear stress presente in collaterali al basale in assenza di ostruzione, loro CE sono allineati con l’asse nave allo stesso grado presente in distale-most arteriole e l’aorta discendente-vasche con alta velocità di flusso laminare ortogrado. Le cellule endoteliali di entrambi i collaterali e arteriole hanno ciglia primarie, e collaterali possiedono meno di loro. Le cellule muscolari lisce dei collaterali sono continue, a differenza di quelle dei DMA. I collaterali hanno livelli più alti di espressione di geni associati a vie pro- e anti-infiammatorie e pro- e anti-proliferazione, rispetto ai DMA. Un bias verso un più alto tasso di proliferazione cellulare nelle cellule murali collaterali è supportato dall’osservazione che i collaterali iniziano ad acquisire tortuosità poco dopo la loro formazione nell’embrione che aumenta fino alla mezza età (16 mesi, 49 anni umani-equivalenti). I risultati di cui sopra forniscono intuizioni in specializzazioni strutturali e molecolari che possono essere alla base delle caratteristiche uniche e le funzioni dei vasi collaterali.

Convergenza del flusso di sangue in collaterali alla linea di base impone basso e “disturbato” flusso / forze di stress di taglio sulle loro cellule murali, cioè, o assenza di flusso o flusso molto basso che oscilla a-and-fro (~ 1-10 volte al minuto) e media zero . Questo si traduce in un aumento dello stress di parete secondo la relazione di Bernoulli. Quando presente altrove nella circolazione arteriosa, ad esempio, alle biforcazioni, l’arco interno dell’aorta o a valle delle placche, lo stress di taglio basso e disturbato favorisce una morfologia CE non allineato acciottolato che è associato con aumento dello stress ossidativo, infiammazione, marcatori di invecchiamento, e bassa attività eNOS/NO (cioè, disfunzione endoteliale) . Sorprendentemente, tuttavia, abbiamo trovato che le CE collaterali hanno lo stesso allineamento (e le dimensioni delle cellule) delle CE nei DMA e nell’aorta discendente. Non abbiamo studiato come questo fenotipo strutturale antinfiammatorio sia specificato. È possibile che una o più delle altre caratteristiche uniche che abbiamo identificato siano coinvolte (vedi sotto). D’altra parte, i dati in Figura 2 per il flusso e lo stress di taglio sono stati ottenuti in animali anestetizzati. Durante i comportamenti sveglio, collaterali possono avere periodi di flusso sostenuto in una o l’altra direzione indotta da cambiamenti nell’attività metabolica regionale nel territorio fornito dagli alberi arteriosi che attraversano-connettere. Non è noto se i collaterali contribuiscono in questo modo alla fisiologica regolazione metabolica del flusso sanguigno e la consegna di ossigeno, cioè, l’accoppiamento neurovascolare nel cervello e iperemia funzionale altrove. Tuttavia, tali periodi di flusso unidirezionale sostenuta potrebbe promuovere l’orientamento CE abbiamo osservato. Indipendentemente dalla causa sottostante, ipotizziamo che il fenotipo allineato di EC collaterali è parte (o un marcatore) di un gruppo di meccanismi di protezione che favoriscono il mantenimento di collaterali e mitigare la loro rarefazione (Figura 9).

A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto che mostra che ECs rivestimento collaterale e arteriole hanno ciglia primarie. Sono molto più abbondanti di quanto riportato in precedenza per i vasi condotti da individui sani (cioè, assenti o presenti su meno dell’1% delle CE): il 18% delle CE collaterali hanno PrC rispetto al 28% per i DMA. Le ciglia primarie sulle EC sono state descritte nel 1984 da Haust nell’aorta di conigli e umani con aterosclerosi. Rapporti successivi hanno descritto le CE ciliate nei capillari della ghiandola pineale di un feto umano di 20 settimane, nel cuore in via di sviluppo e nei foglietti della valvola aortica, e riferimenti ivi], circondando gli ateromi, ectopicamente nell’arteria carotide comune di topi ApoE-/-, e in individui sani alle biforcazioni delle arterie condotte e nella curvatura interna dell’arco aortico; per contrasto le ciglia sono assenti o quasi nelle regioni delle arterie dove lo shear stress è laminare. La maggior parte degli altri tipi di cellule esprimono PrC durante lo sviluppo, in determinate condizioni di coltura cellulare, e negli adulti. A seconda del tipo di cellula, le PrC partecipano alla specificazione dell’asimmetria dell’embrione, alla disposizione dei centrioli, alla proliferazione/regolazione del ciclo cellulare, all’autofagia, alla meccanotrasduzione sensibile al flusso, alla chemiocezione e alla compartimentazione e al traffico delle proteine di segnalazione tra il cilioplasma, il citoplasma e il nucleoplasma (ad esempio, per Gli e PDGFRα). Quando presenti, le ciglia sono più abbondanti nelle cellule non proliferanti, con l’estremità prossimale ancorata in un’invaginazione del plasmalemma (tasca ciliare) nelle CE e in altri tipi di cellule, ma non in tutti. Le ciglia primarie sono complessate con il centriolo madre del corpo basale che si collega al centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Lo smontaggio/riassorbimento del cilio durante la fase S e la liberazione del centriolo sono essenziali per la divisione cellulare. Poiché i PrC sono collegati al citoscheletro attraverso il MTOC, la flessione ciliare indotta dal flusso nelle CE è in grado di essere trasmessa in tutta la cellula, comprese le giunzioni cellula-cellula e cellula-matrice. Le ciglia primarie trasducono lo stress da taglio del fluido nelle cellule epiteliali tubulari renali e nelle CE attraverso un percorso che è eccezionalmente sensibile allo stress da taglio e coinvolge la policistina-1 e la policistina-2, che sono codificate da Pkd1 e Pkd2. La policistina-1 ha proprietà meccanosensibili mentre la policistina-2 è un canale del calcio TRP. Entrambe le proteine sono necessarie per percepire lo stress da taglio e a loro volta rilasciano ossido nitrico. Difetti in PrC sono associati a molte anomalie. Per esempio, le mutazioni di PKD1 e PKD2 sono causali per la malattia policistica renale autosomica dominante, con le CE del rene e le cellule tubulari dei pazienti che evidenziano risposte carenti di calcio e NO e una maggiore proliferazione.

Le ciglia primarie sono assenti nelle CE della vena ombelicale umana mantenute sotto stress di taglio laminare e in quiescenza proliferativa in coltura cellulare. Nelle vene ombelicali umane meno dell’uno per cento delle CE hanno ciglia che sporgono nel lume, mentre in una frazione maggiore le ciglia sono situate intracellularmente. L’aorta embrionale e le CE coltivate da essa hanno un singolo cilio che si proietta nel lume. Le ciglia endoteliali sono presenti nelle regioni ad alto shear stress durante lo sviluppo embrionale, insieme all’espressione del fattore di trascrizione sensibile allo shear stress, KLF2, che transattiva eNOS e altri geni anti-infiammatori e anti-proliferativi. Nelle regioni con basso o disturbato shear stress PrC sono disassemblati / assenti e l’espressione di Klf2 e eNOS sono aboliti e ridotti, rispettivamente. L’espressione di Klf2 è anche inibita in ECs non ciliate isolate da arterie embrionali, e la rimozione chimica di PrC da ECs in cultura ha un effetto simile, cioè, abolendo l’espressione Klf2 . È interessante notare che nelle CE di topi adulti ApoE-/-, che hanno disfunzioni endoteliali ma non sviluppano placche, le ciglia sono espresse ectopicamente nell’arteria carotide comune nonostante la presenza di flusso laminare, rispetto ai topi wildtype che sono privi di ciglia. Cilia sono stati persi quando elevato stress di taglio è stato indotto tramite l’impianto di un flusso limitando cast intorno alla nave. L’ingessatura delle carotidi comuni nei topi wildtype ha indotto la ciliogenesi solo nelle regioni di basso e disturbato stress da taglio. Questi risultati suggeriscono che l’espressione di PrC su ECs in vivo negli adulti è limitata alle regioni di basso / disturbato shear stress, ma può verificarsi ectopicamente nelle arterie con flusso laminare in presenza di disfunzione endoteliale causata da iperlipidemia e forse altri fattori di rischio vascolare. Da notare, in altamente ciliato, disturbato flusso aree come la curvatura interna dell’arco aortico o a valle di placche, circa il 25% delle CE hanno un singolo cilium mentre il resto sono privi, una percentuale simile a quello che abbiamo osservato in arteriole e collaterali.

I nostri risultati che PrC sono presenti anche su arteriole e collaterali in topi adulti giovani sani evidenziano la necessità di studi che esaminano la funzione delle ciglia in questi tipi di navi. Questo include la determinazione se la nostra osservazione di un minor numero di cilia su EC collaterali che arteriole ha un significato funzionale. Le cellule endoteliali sono accoppiate meccanicamente, elettricamente e diffusamente alle EC e alle SMC adiacenti, quindi solo una frazione delle EC potrebbe aver bisogno di esprimere cilia per la trasduzione di segnali meccano-sensibili o di altro tipo. Un elevato stress da taglio provoca lo smontaggio delle ciglia nelle EC in coltura, mentre l’inversione del flusso oscillatorio induce la loro espressione. Noi ipotizziamo che le cilia su arteriole e CE collaterali possono riflettere il flusso inferiore / stress di taglio in arteriole e flusso molto basso e disturbato in collaterali e che meno PrC su CE collaterali possono servire a ridurre la loro sensibilità al prevalente ambiente disturbato stress di taglio. In altre parole, un minor numero di cilia sulle CE collaterali può essere parte di un repertorio di adattamenti che bilanciano o si oppongono – attraverso l’espressione mantenuta o aumentata di KLF2/4, eNOS e altri fattori antinfiammatori/antiproliferativi – ai segnali infiammatori, ossidativi, proliferativi e apoptotici di basso grado promossi dall’ambiente emodinamico disturbato presente nelle collaterali (Figura 9). Egorova et al. hanno proposto qualcosa di simile, cioè che, poiché la presenza di PrC sulle CE è associata all’espressione di KLF2, le ciglia endoteliali possono segnalare un freno all’attivazione delle CE nelle regioni di flusso basso e disturbato. Un ruolo protettivo per le ciglia in queste regioni è supportato dalla recente relazione che la rimozione delle ciglia endoteliali utilizzando la delezione condizionale di Ift88 ha aumentato l’aterosclerosi e l’espressione genica infiammatoria, e diminuito l’attività eNOS in topi Apoe-/- alimentati con una dieta ricca di grassi, e che l’endotelio diventa sensibilizzato nelle regioni atero-prone a subire la differenziazione osteogenica in Tg737 (orpk/orpk) topi cilium-defective. È anche possibile che se PrC sono protettivi, meno di loro in collaterali potrebbe contribuire alla suscettibilità elevata di questi vasi alla rarefazione da invecchiamento e altri fattori di rischio vascolare. Tuttavia, un minor numero di ciglia sui collaterali potrebbe semplicemente riflettere un effetto secondario o di passaggio, essendo una conseguenza, per esempio, di un più alto tasso di proliferazione intrinseca di EC collaterali come evidenziato dal progressivo aumento della tortuosità collaterale (discusso di seguito), dal momento che la presenza di PrC e la loro associazione con il corpo basale è creduto per favorire la rimozione delle cellule dal ciclo cellulare. Studi futuri saranno necessari per determinare se la nostra scoperta di ciglia multiple su ECs riflette ECs che hanno subito la senescenza proliferativa e associato fallito citochinesis e poliploidia nucleare.

Di recente è stato dimostrato che le CE nella retina del topo in via di sviluppo si affidano alla PrC per stabilizzare le connessioni dei vasi durante il rimodellamento del plesso vascolare in regioni con stress di taglio da basso a intermedio. Cilia endoteliali senso flusso in embrioni di zebrafish, partecipare al reclutamento di cellule murali ai vasi arteriosi fated, e sono necessari per la normale morfogenesi vascolare. Il numero e il diametro dei collateri diminuisce a partire dalla mezza età. Questa rarefazione indotta dall’età è fortemente accelerata dalla carenza di eNOS/NO genetica o farmacologicamente indotta o dalla presenza di fattori di rischio vascolare. L’aumento dello shear stress induce il rimodellamento collaterale verso l’esterno a seguito di un’ostruzione arteriosa acuta o a lento sviluppo. I topi Pkd1+/- e i pazienti con malattia policistica renale autosomica dominante presentano una disfunzione eNOS/NO endoteliale. Sarà importante esaminare in studi futuri se PrC collaterale partecipare a una o più delle funzioni di cui sopra utilizzando EC-specifica riduzione di policistina-1, dal momento che: 1) la sua carenza porta ad un’alterazione della funzione ciliare, 2) la policistina-1 insieme alla policistina-2 partecipa al flow-sensing della PrC, 3) le forme mutanti di entrambe le proteine causano la malattia policistica del rene, 4) è dimostrato che VHL, indipendentemente dal suo ruolo nella degradazione di Hif1α, insieme a GSK3β sono richiesti per la manutenzione strutturale del cilio, e 5) la proteina Rabep2, che è richiesta per la collaterogenesi, è un nuovo substrato di GSK3β, si localizza al complesso cilio-corpo basale, e il suo abbattimento porta alla ciliogenesi difettosa. Altri approcci per interferire con la presenza e la funzione delle ciglia, ad esempio, con il knockdown di altre proteine ciliari come Pkd2 e Ift88, dovranno anche essere esaminati.

In contrasto con le arteriole distali, che hanno SMC sparse e discontinue in vari tessuti tra cui la retina (non siamo stati in grado di identificare studi nel cervello), le SMC erano continue sui collaterali. Noi ipotizziamo che questo possa essere un aumento adattativo dello spessore della parete per bilanciare l’aumento dello stress della parete circonferenziale causato dalla conversione, specificata da Bernoulli, dell’energia cinetica del flusso in una maggiore energia potenziale (pressione transmurale) come conseguenza della convergenza del flusso nei collateriali. Sarebbe interessante esaminare se la composizione e la quantità di matrice extracellulare, che potrebbe aiutare le SMC a bilanciare l’aumento dello stress di parete nei collaterali, differisce nei collaterali rispetto alle arteriole. Da notare, nonostante la loro maggiore copertura SMC, collaterali hanno meno piuttosto che più tono rispetto alle arteriole di dimensioni simili, e la mancanza di reattività miogenica – ulteriori caratteristiche uniche di vasi collaterali.

Il disturbato emodinamico, ambiente pro-ossidativo in cui risiedono le cellule murali collaterali ci ha portato a esaminare se l’espressione dei geni coinvolti in infiammazione, proliferazione cellulare, invecchiamento e angiogenesi differiscono per collaterali rispetto alle arteriole distali. Collaterals visualizzato aumentato livelli di mRNA per il pro-infiammatorio, pro-apoptosi inflammasoma gene, Pycard, i geni pro-proliferativi, Ki67, Pdgfb, e Angpt2, il gene anti-proliferativo, Dll4, e il differenziato arterioso di tipo CE gene marcatore, Ephrinb2. Tuttavia, l’espressione dei geni inibitori del ciclo cellulare, p21, p27 e p53, non erano diversi, né lo erano altri geni associati alla proliferazione, all’arresto del ciclo cellulare e all’invecchiamento (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomerasi). Né c’erano differenze nell’espressione di altri geni associati alla proliferazione CE e/o SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) e che sono richiesti (nel caso dei primi tre geni) per la formazione di collaterali durante lo sviluppo o coinvolti nella specificazione della differenziazione e quiescenza CE e SMC (Tgfb, Angpt1). L’aumento dell’espressione da parte dei collaterali dei geni pro-proliferazione di cui sopra è coerente con le nostre misure di tortuosità, che suggeriscono che le cellule murali collaterali hanno un tasso di proliferazione più elevato, rispetto ad altri vasi arteriosi: tortuosità collaterale era evidente dal primo giorno dopo la nascita, ha continuato ad aumentare fino alla mezza età, e poi è diminuito. Quest’ultimo si è verificato allo stesso tempo che i collateri sperimentano un declino del numero e del diametro con l’invecchiamento avanzato. Questi risultati supportano l’ipotesi che la rarefazione collaterale associata all’età è causata dalla senescenza proliferativa e dalla successiva apoptosi delle CE e delle SMC collaterali a causa di un aumento del tasso di proliferazione nel corso della vita causato dall’ambiente emodinamico disturbato e dal basso contenuto di ossigeno nel sangue in cui risiedono i collaterali (Figura 9).

Collaterals anche visualizzato una maggiore attività di eNOS, che studi precedenti hanno dimostrato si oppone rarefazione di collaterali causati da invecchiamento e altri fattori di rischio vascolare. eNOS-derivato NO inibisce lo stress ossidativo, infiammazione, proliferazione, adesione dei leucociti, aggregazione piastrinica, e l’invecchiamento cellulare e promuove SMC rilassamento. Poiché lo stress da taglio è uno stimolo prossimale per l’NO derivato da eNOS, un aumento di eNOS/NO nei collaterali con il loro ambiente di stress da taglio basso e disturbato può ridurre l’effetto dei fattori che promuovono la rarefazione collaterale (Figura 9). Allo stesso modo, l’espressione mantenuta dei fattori di trascrizione sensibili allo sforzo di taglio della CE, Klf2 e Klf4, nei collaterali nonostante il loro flusso basso e oscillatorio, che inibisce l’espressione di questi fattori altrove nei vasi arteriosi con flusso disturbato, può agire come ulteriori fattori di “bilanciamento” o specializzazioni collaterali, insieme all’aumento di eNOS, CE allineate, meno ciglia, robusta copertura SMC, e aumento di ephrin-B2 e Dll4. L’espressione di KLF2 e KLF4, che regolano negativamente la proliferazione, l’infiammazione e l’angiogenesi, upregolano l’eNOS e sono fortemente downregolati nei siti di basso e disturbato shear stress, non erano diversi nei collaterali rispetto ai DMA. È interessante notare che le PrC promuovono l’espressione di Klf2, Klf4 ed eNOS.

Un limite degli studi di cui sopra è che l’RNA è stato ottenuto da vasi sezionati, che sono composti da CE, SMC e, anche se meno, periciti, fibroblasti e cellule mieloidi residenti. Sono necessari studi che impiegano la separazione dei tipi di cellule e l’esame di una più ampia gamma di geni e dei loro rispettivi livelli di proteine. Tuttavia, la difficoltà di sezionare manualmente collaterali e arteriole distali nel numero richiesto, l’effetto delle tecniche di dissociazione delle cellule sui livelli di base di RNA e proteine, l’assenza di modelli di coltura cellulare di “collaterale” ECs e SMCs, e la mancanza ancora di qualsiasi gene marcatore collaterale-specifico, precludono l’uso di questi approcci. Da notare, tuttavia, l’espressione di molti dei geni esaminati sono specifici o arricchiti per le CE, ad esempio, Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 e Klf4. Tuttavia, l’analisi della trascrizione genica non sempre riflette i cambiamenti nel livello o nella funzione della proteina; quindi l’indagine dello stress ossidativo, infiammatorio, proliferazione o senescenza dei marcatori a livello della proteina può riflettere meglio le differenze nelle caratteristiche cellulari.