Saggio di invasione

Materiali:

Piastra di coltura cellulare Falcon a 24 pozzetti

Inserto di coltura cellulare Falcon:Dimensione pori 8μm, formato 24 pozzetti

Cat# 3097

Matrigel (diluito inDMEM/F12)

5% Glutaraldeide in 1XPBS

0.5% blu di toluidina in 2% Na2CO3

Preparazione della camera di Boyden:

1. Utilizzando le pinze sterili rimuovere gli inserti delle pareti cellulari dalla loro confezione e metterli nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
2. Lavare gli inserti 2 volte con 300μl DMEM/F12

(Attenzione a non pugnalare la membrana)

1. Aggiungere 20μl di 1:6 diluito Matrigel (2-3 mg / ml di proteine) al centro di ogni inserto di cella bene. Distribuire delicatamente il Matrigel su tutta la superficie della membrana.
2. Posizionare gli inserti rivestiti in incubatore per consentire al Matrigel di solidificare per 20-30 min.

Preparazione delle cellule per il test:

1. Trattare e crescere le cellule secondo le condizioni sperimentali. Può essere auspicabile sincronizzare le cellule allo stesso stato di crescita.
2. Tripsinizzazione e conteggio delle cellule
3. Rimuovere la tripsina e risospendere con terreno fresco.
4. Piastra 1X105 cellule in 200 μl di terreno definito nella camera superiore.
5. Aggiungere 300 μl di mezzo nella camera inferiore.
6. Coltivare per circa 20 ore.

Il tempo varia per diverse linee cellulari e può essere fino a 48 ore per le cellule meno invasive.

Fissazione e colorazione:

1. Dopo la cultura, aspirare il mezzo dalla camera inferiore
2. Aggiungere 0,5 ml di glutaraldeide 5% in 1XPBS, incubare per 10 min. @ R.T
3. Aspirare la soluzione di glutaraldeide, lavare ogni pozzetto 3 volte con D.W
4. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di colorazione 0,5% Toluidine Blue nella camera inferiore, incubare per 10-20 min @ R.T
5. Aspirare la soluzione dalla camera superiore e inferiore, lavare la camera inferiore 3 volte con D.W
6. Pulire accuratamente la superficie interna della camera superiore utilizzando un bastoncino di cotone. (Fare attenzione a non premere troppo saldamente, la membrana potrebbe saltare fuori). Le cellule invase saranno al centro del fondo della membrana.
7. Contare il numero di cellule con q obiettivo 20X del microscopio. Contare almeno 3 campi per membrana.