Abstract
Si descrive la derivazione di un modello quantitativo del metabolismo della fenilalanina nell’uomo. Il modello si basa sulle proprietà cinetiche della fenilalanina idrossilasi umana pura ricombinante e sulle stime dei tassi in vivo della transaminazione della fenilalanina e della degradazione della proteina. I valori calcolati per la concentrazione allo stato stazionario della fenilalanina nel sangue, il tasso di eliminazione della fenilalanina dal sangue dopo un carico orale dell’aminoacido e la tolleranza alimentare della fenilalanina sono tutti d’accordo con i dati di pazienti normali, fenilchetonurici ed eterozigoti obbligatori. Questi valori calcolati possono aiutare nella decisione sul grado di restrizione dell’assunzione di fenilalanina che è necessario per ottenere un risultato clinico soddisfacente nei pazienti classici e in quelli con forme più lievi della malattia.
Il passo iniziale e limitante nel catabolismo completo della fenilalanina in CO2 e acqua è la sua idrossilazione in tirosina, una reazione catalizzata dal sistema idrossilante della fenilalanina. Il sistema è complesso, costituito da fenilalanina idrossilasi (IPA), il coenzima pterina tetraidrobiopterina (BH4), e diversi enzimi che servono a rigenerare BH4, cioè diidropteridina reduttasi e pterina 4α-carbinolamina deidratasi (1, 2).
Anche se l’anello benzenico della fenilalanina non può essere rotto senza essere prima idrossilato in posizione para, la catena laterale di alanina dell’aminoacido può essere metabolizzata anche in assenza del passaggio di idrossilazione dell’anello. Questa via alternativa è iniziata dalla transaminazione della fenilalanina a fenilpiruvato seguita dalla conversione di quest’ultimo composto in metaboliti come il fenil lattato, il fenilacetato e l’o-idrossifenilacetato. I prodotti della via della transaminasi sono escreti nelle urine. Le fasi di queste vie alternative del metabolismo della fenilalanina sono descritte nella Fig. 1.
All’inizio, va notato che un precedente tentativo di effettuare una tale analisi è stato ostacolato dalla mancanza di dati sulle proprietà cinetiche dell’IPA umana e della fenilalanina transaminasi umana. Infatti, per quest’ultimo enzima, anche l’identità del responsabile di questa attività in vivo non era nota con certezza. Poiché le prove in vitro indicavano che la fenilalanina è un eccellente substrato per l’aspartato aminotransferasi mitocondriale, si è supposto che fosse questa la transaminasi coinvolta. Inoltre, poiché le proprietà della controparte umana non erano note, sono state utilizzate le proprietà cinetiche del corrispondente enzima del ratto (12). Il modo in cui il problema della transaminasi umana è stato gestito nella presente analisi sarà discusso di seguito.
Le proprietà cinetiche dell’IPA umano ricombinante sono ora disponibili (16, 17). La cinetica dell’IPA è in qualche modo complicata dal fatto che la fenilalanina non serve solo come substrato per l’enzima, ma anche come attivatore (vedi rif. 1 e riferimenti ivi contenuti). Poiché una precedente analisi del comportamento cinetico dell’IPA basata su un modello a due siti con legame ordinato della fenilalanina sia in un sito catalitico che in un sito regolatore potrebbe rendere conto adeguatamente di molti aspetti peculiari del comportamento cinetico dell’enzima (18), nella presente analisi è stato utilizzato un modello simile a due siti con legame ordinato. L’equazione di velocità effettiva utilizzata (19) è mostrata nell’Eq. 2, dove Km è la concentrazione di fenilalanina che dà metà della velocità massima e Ka è la concentrazione di fenilalanina che dà metà della massima attivazione in un esperimento in cui l’IPA è stato preincubato con varie concentrazioni di fenilalanina. Per la presente analisi, sono state utilizzate le seguenti costanti cinetiche, determinate con IPA umano ricombinante puro a 37°C con BH4 come coenzima: Km per la fenilalanina, 0,51 mM, e Ka per la fenilalanina come attivatore, 0,54 mM (D. Kowlessur e S.K., dati non pubblicati). Un valore approssimativo di Vmax per l’IPA umana (16) (probabilmente una sottostima) è stato calcolato dal tasso iniziale di diminuzione dei livelli di fenilalanina nel siero (0,9 μmol/ml per h) in soggetti di controllo dopo che avevano ricevuto un carico orale di l-fenilalanina sufficiente ad aumentare i loro livelli di fenilalanina nel siero di ≈17 volte (20). 
2 Come indicato sopra, il precedente problema dell’identità dell’enzima che nell’uomo è responsabile della transaminazione della fenilalanina è stato bypassato nella presente analisi. Si è supposto che la via principale per lo smaltimento netto della fenilalanina nei pazienti PKU classici sia la transaminazione. Per esempio, come già detto, l’escrezione urinaria di fenilalanina è solo ≈11% della quantità che viene transaminata, e, alla fine del primo anno di vita, si può stimare che la quantità di fenilalanina smaltita tramite incorporazione nelle proteine sia solo ≈25% di quella smaltita tramite transaminazione. Va notato che con il presente metodo per stimare il tasso di transaminasi della fenilalanina, che si basa sul tasso di clearance della fenilalanina dal sangue, le reazioni minori per lo smaltimento della fenilalanina, come la sua escrezione urinaria e la sua incorporazione nelle proteine, sono sussunte nella stima dell’attività della transaminasi, con conseguente piccola sovrastima di questa attività.
Per essere utili nella presente analisi, sono necessari valori per il Km e la Vmax della transaminasi. Si è tentato di estrarre un valore di Km per la transaminazione della fenilalanina dai risultati dei test di carico di fenilalanina effettuati su pazienti PKU classici (21). L’approccio adottato per stimare un valore di Vmax per l’enzima transaminatorio umano è stato quello di utilizzare i dati sulla somma di tutti i metaboliti derivati dalla transaminazione (cioè fenilpiruvato, fenil lattato e o-idrossifenilacetato) escreti da un gruppo di pazienti PKU classici in funzione dei loro livelli plasmatici di fenilalanina. La quantità massima escreta, espressa in mmol/mol di creatinina, era di 1.370, un livello che sembrava stabilizzarsi a livelli plasmatici di fenilalanina tra 1.200 e 2.400 μmol/litro (22).
I tentativi di convertire questo valore in un tasso di transaminazione sono complicati dalla vasta gamma di età, da ≈2 anni a ≈18 anni, nel campione di pazienti usato nello studio. Per la presente analisi, si è assunto che il peso corporeo medio dei pazienti fosse di 50 kg e che l’escrezione giornaliera di creatinina fosse di 2 g/24 h (23). Un’ulteriore ipotesi è stata fatta che l’escrezione dei metaboliti derivati dalle transaminasi avvenga ad un tasso lineare durante il periodo di 24 ore e rifletta il tasso di formazione di questi metaboliti. Si è anche ipotizzato che questi composti si equilibrino con tutti i compartimenti del fluido corporeo tranne il tessuto connettivo denso della cartilagine e l’osso, che, insieme, rappresentano il 15% dell’acqua corporea totale (24), producendo un volume di distribuzione dell’acqua accessibile di 500 ml/kg di peso corporeo. Sulla base di questi presupposti, il tasso massimo di transaminazione è stato calcolato a 0,043 μmol/ml per h.
Un ulteriore prodotto del metabolismo della fenilalanina che deriva, almeno in parte, dal fenilpiruvato che non è stato misurato nello studio di Langenbeck et al. (22) è la fenilacetilglutamina (PAG). Ci sono prove che la PAG può essere formata dal fenilacetato, che deriva dal fenilpiruvato per decarbossilazione ossidativa (25). È stato anche proposto che il fenilacetato e, quindi, la PAG, si possa formare dalla fenilalanina per una via che non coinvolge la transaminazione, ma comporta invece la decarbossilazione a feniletilamina seguita dall’ossidazione dell’ammina a fenilacetato (26). La scoperta che la quantità di feniletilammina escreta nei pazienti PKU è piccola anche dopo che l’ossidazione dell’ammina è stata bloccata dalla somministrazione di un inibitore dell’ammina ossidasi (27), tuttavia, indica che, come discusso in precedenza (12), la decarbossilazione della fenilalanina è una via quantitativamente minore per il metabolismo della fenilalanina, così come per la formazione di PAG.
La quantità di PAG escreta dagli individui normali è di 250-500 mg/giorno; i pazienti PKU ne escono il doppio (28). Per calcolare la quantità di PAG formata attraverso la via delle transaminasi, è stata fatta l’ipotesi conservativa che solo la quantità “extra” escreta dai pazienti deriva dal fenilpiruvato. Prendendo la quantità media extra di PAG escreta come 350 mg/giorno e facendo le stesse ipotesi di cui sopra, questa escrezione si traduce in un tasso di formazione di PAG di 0,020 μmol/ml per h, portando il tasso di formazione di tutti i prodotti transaminati a 0,063 μmol/ml per h.
Utilizzando questo valore di Vmax, i risultati del test di carico di fenilalanina effettuato su pazienti PKU classici (21) sono stati utilizzati per calcolare un valore di 1.37 ± 0,14 mM (media ± SD, n = 3) per il Km della fenilalanina transaminasi.
Perché nella presente analisi, le attività dell’IPA e della transaminasi sono calcolate in funzione dei livelli di fenilalanina nel sangue, è importante che questi livelli riflettano i livelli di tessuto dell’aminoacido. Pertinente a questo punto, i livelli di fenilalanina nel tessuto epatico di un paziente PKU (29), così come nel tessuto epatico e renale di ratti iperfenilalanemici (30), sono stati riportati come comparabili ai livelli corrispondenti nel sangue.
Il terzo termine dell’Eq. 2, il tasso di degradazione netta delle proteine, è stato stimato dai dati di Waterlow e Jackson (31), mostrando che nello stato di digiuno, lo stato in cui viene effettuato il test di carico della fenilalanina, la degradazione netta delle proteine (cioè, la quantità di proteine demolite meno la quantità sintetizzata) è uguale a 0,30 g/kg di peso corporeo per 12 ore. Poiché il muscolo scheletrico costituisce il ≈40% della massa corporea (24) e il catabolismo proteico in questo tessuto gioca un ruolo importante nella consegna degli aminoacidi alla periferia, la degradazione proteica nel muscolo scheletrico è stata presa come l’evento predominante nella degradazione delle proteine che avviene durante il digiuno.
Il muscolo scheletrico umano contiene ≈46 μmol di fenilalanina/g tessuto (32). Sulla base di questo valore e della constatazione che il muscolo umano adulto contiene il 19,8% di proteine (33), si può stimare che il muscolo contiene 232 μmol di fenilalanina/g di proteine muscolari. Se questo valore viene preso come rappresentativo delle riserve proteiche del corpo, indicherebbe che ≈70 μmol di fenilalanina/kg di peso corporeo per 12 ore verrebbero liberati durante il periodo di digiuno. Sulla base delle stesse ipotesi di quelle fatte sopra nella stima del tasso di transaminazione della fenilalanina, l’ultimo valore si tradurrebbe in un tasso orario di degradazione proteica netta (e di rilascio di fenilalanina da questo processo) di 0,012 μmol/ml per h. Poiché il substrato per questa reazione, cioè le riserve corporee di proteine, rimarrebbe probabilmente relativamente costante durante un breve periodo di digiuno, la degradazione proteica è stata assunta per seguire una cinetica di ordine zero.
Sostituendo i valori stimati per le costanti cinetiche per le tre reazioni mostrate nell’Eq. 1 si ottiene l’Eq. 3: 
3
RESULTS AND DISCUSSION
La validità generale dell’Eq. 3 può essere valutata in diversi modi. In primo luogo, con l’uso dell’espressione per la velocità della reazione catalizzata dall’IPA, comprese le costanti cinetiche indicate nell’equazione, il tasso basale della reazione di idrossilazione è stato calcolato essere 0,010 μmol/ml per h. Questo valore concorda bene con i seguenti valori riportati per soggetti normali sulla base di esperimenti in cui i soggetti sono stati infusi con l-fenilalanina: 0.013 μmol/ml per h; 0.008 μmol/ml per h (34); 0.012 μmol/ml per h (5); 0.010 μmol/ml per h (6). Un valore di 0,020 μmol/ml per h è stato trovato nell’ultimo studio quando i soggetti sono stati infusi con l-fenilalanina (6). I tassi citati in vivo per la conversione della fenilalanina in tirosina sono stati tutti riportati come μmol/h per kg. Sono stati convertiti in μmol/ml per h sulla base delle stesse ipotesi usate in precedenza, cioè che la distribuzione in volume dei metaboliti come la fenilalanina è di 500 ml/kg di peso corporeo. Questi risultati mostrano che il tasso calcolato di idrossilazione della fenilalanina concorda bene con i tassi determinati sperimentalmente.
Un altro test della validità del modello consiste nel calcolare il livello di fenilalanina nel sangue allo stato stazionario sia per i soggetti di controllo che per gli eterozigoti PKU che si presume abbiano il 50% della normale attività PAH, così come il t1/2 per la clearance di un carico di fenilalanina (cioè, il tempo necessario affinché la concentrazione iniziale di fenilalanina diminuisca a metà del suo valore originale) dal sangue per questi due gruppi. Il livello di fenilalanina allo stato stazionario per i controlli, calcolato dall’Eq. 3 (impostando il termine “-dPhe/dt” uguale a zero e calcolando la concentrazione di fenilalanina), è 0,059 mM e quello per i soggetti con il 50% di attività residua PAH è 0,079 mM, 1,34 volte superiore al livello di controllo. Anche se il valore di 0,059 mM per i soggetti normali concorda bene con il valore accettato di 0,058 ± 0,015 mM (media e SD) (35), il valore di 0,079 mM per gli eterozigoti che potrebbero avere il 50% del livello normale di PAH, sembra essere troppo basso. Il rapporto dei livelli di fenilalanina nel sangue per i controlli e per gli eterozigoti PKU obbligati è stato riportato nell’intervallo 1,57-1,61 (36-38) piuttosto che il rapporto di 1,34 previsto dal modello.
Questo valore calcolato solleva la possibilità che gli eterozigoti PKU possano avere meno del 50% dell’attività PAH di controllo. Sostituendo un valore del 40% dell’attività IPA di controllo per gli eterozigoti nell’Eq. 3 si ottiene una concentrazione di fenilalanina allo stato stazionario di 0,093 mM; utilizzando questo valore e il valore di 0,058 mM per i controlli, si ottiene un rapporto di 1,60, che è vicino all’intervallo riportato per eterozigoti e controlli (vedi sopra). A questo proposito, va notato che l’attività IPA residua nei campioni di biopsia epatica trovati per sei eterozigoti obbligati HPA variava tra il 5,8 e il 31% dei valori di controllo (39). Questi risultati hanno fornito la prima indicazione che gli eterozigoti HPA hanno significativamente meno del 50% dell’attività di controllo. Due studi successivi più ampi su genitori di pazienti con PKU erano in accordo con questi risultati precedenti: uno studio ha riportato un valore medio del 29,3% dei controlli (n = 9) (40) e un altro ha riportato un valore medio del 28,1% (n = 8) (41).
Il modello predice anche valori t1/2 per la clearance della fenilalanina dal sangue sia per i normali che per gli eterozigoti che sono in accordo con i risultati clinici reali. Per i normali, si ottiene un valore di 65 min, che è inferiore al valore medio riportato di 89 min ma ben all’interno dell’intervallo di 60-120 min (10). Per gli eterozigoti con il 50 e il 40% di attività residua PAH, i valori t1/2 calcolati dall’Eq. 3 sono 144 e 180 min, rispettivamente, rispetto a un valore medio riportato di 159 min.
Si è fatto riferimento in precedenza a un rapporto di due pazienti HPA la cui incapacità di metabolizzare la fenilalanina sembrava essere il risultato di un deficit di transaminasi (11) e alle prove contro questa conclusione (12). Il presente modello fornisce una ragione in più per vedere questa affermazione con scetticismo. La Fig. 2 mostra l’andamento temporale della scomparsa di 1 mM di fenilalanina dal plasma di un soggetto di controllo (curva A) e di uno privo di transaminasi ma con livelli normali di IPA (curva B). Come si può vedere, i due tassi sono quasi gli stessi, rendendo estremamente improbabile che un HPA pronunciato possa essere causato da una mancanza di transaminasi. La ragione della quasi identità dei due tassi è che il tasso di scomparsa della fenilalanina in totale assenza di IPA (curva D) è molto piccolo, essendo il tasso iniziale solo il 2,6% di quello di un controllo con livelli di IPA normali. La Fig. 2 (curva C) mostra anche il tasso di smaltimento della fenilalanina in un individuo con il 40% del livello normale di IPA, un deficit di attività IPA che, come discusso sopra, può rappresentare la media per gli eterozigoti PKU.
Tassi calcolati di clearance di un carico di fenilalanina per controlli e per individui con diversi genotipi. A, controlli; B, soggetto con attività transaminasica pari a zero; C, soggetto con attività IPA pari al 40% del controllo; D, soggetto con attività IPA pari allo 0% del controllo.
Di recente, i pazienti PKU sono stati classificati assegnandoli a categorie di fenotipi sulla base della loro tolleranza alla fenilalanina nella dieta. I pazienti con PKU classica tollerano meno di 20 mg/kg di fenilalanina al giorno per mantenere i loro livelli di fenilalanina nel sangue al livello accettato di 0,3 mM, quelli con “PKU moderata” tollerano 20-25 mg/kg al giorno, e quelli con “PKU lieve” tollerano 25-50 mg/kg al giorno (42).
Per vedere se questi valori di tolleranza alla fenilalanina nella dieta sono coerenti con le previsioni fatte dall’Eq. 3, si è supposto che l’assunzione della quantità consentita di fenilalanina fosse divisa equamente in tre “pasti”. Per i pazienti PKU classici con un’assunzione di fenilalanina di 15 mg/kg al giorno, ogni pasto conterrebbe 5 mg/kg al giorno e aggiungerebbe 0,06 μmol/ml al valore di base di 0,30 μmol/ml per un livello totale di fenilalanina nel plasma di 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Sostituendo questo valore nell’Eq. 3 (assumendo che la Vmax per un paziente PKU classico sia uguale a zero), -dPhe/dt è uguale a 0,001 μmol/ml per ora, cioè, a questo livello di fenilalanina, la velocità di scomparsa della fenilalanina attraverso la reazione di transaminazione supera appena la velocità di ingresso della fenilalanina nel pool plasmatico attraverso la degradazione netta delle proteine. Pertanto, l’Eq. 3 prevede che questi pazienti PKU potrebbero tollerare un’assunzione di fenilalanina di 15 mg/kg al giorno.
Calcolato nello stesso modo, i pazienti “moderati PKU” con una tolleranza alla fenilalanina nella dieta di 25 mg/kg al giorno richiederebbero un’attività residua PAH pari al 15% di quella del wild type per metabolizzarla in 3. 5 h.Analogamente, i pazienti con “PKU lieve” con una tolleranza alla fenilalanina nella dieta di 50 mg/kg al giorno richiederebbero un livello residuo di IPA pari al 25% del livello wild-type per metabolizzare la fenilalanina aggiunta in circa 3 ore.Questi risultati indicano che l’Eq. 3 può spiegare la tolleranza alla fenilalanina alimentare osservata in questi diversi gruppi di pazienti.
Sarebbe utile cercare di correlare queste stime dell’attività residua dell’IPA per i pazienti “PKU lieve” e “PKU moderata” con l’attività residua dell’idrossilasi misurata in vitro per le specie di IPA mutanti ospitate dai pazienti. Al momento, tuttavia, tale tentativo è ostacolato dal fatto che c’è troppa dispersione nei dati in vitro. Così, diversi pazienti classificati come affetti da “PKU moderata” (42) hanno dimostrato di ospitare le seguenti tre forme mutanti di IPA (con le loro attività residue di IPA in vitro espresse come percentuale delle attività wild-type, indicate tra parentesi): L348V (25%), R261Q (30%, 47%), e R158Q (10%) (43). Si può notare che questi valori variano di quasi 5 volte. Come discusso in precedenza (2, 43), in generale, le stime in vitro dell’attività residua dell’idrossilasi dei mutanti IPA tendono ad essere più alte di quelle osservate nelle biopsie epatiche. Almeno una ragione per questa tendenza è che le attività IPA in vitro sono abitualmente misurate utilizzando concentrazioni saturanti di fenilalanina e BH4, come è stato fatto per il mutante R261Q (44). Data questa situazione, è possibile che le attività IPA residue stimate con l’uso dell’Eq. 3 possano rivelarsi un riflesso migliore delle attività in vivo rispetto a quelle misurate in vitro.
Il presente modello di metabolismo della fenilalanina è rilevante per la conclusione raggiunta da Thompson e dai suoi colleghi (45, 46), sulla base dei risultati ottenuti mediante infusione di soggetti con fenilalanina e tirosina marcate con deuterio, che i pazienti PKU classici hanno un’attività IPA “sostanziale” pari a circa il 76% di quella dei soggetti di controllo. Questa sorprendente attività di idrossilazione della fenilalanina è stata attribuita alla tirosina idrossilasi (45). Come già discusso, i risultati riassunti nella Fig. 2 mostrano che in assenza di IPA, una dose di fenilalanina viene eliminata dal sangue a meno del 3% del tasso visto nei controlli. Non vi è alcuna indicazione dalla presente analisi che qualsiasi percorso alternativo esiste negli esseri umani che può smaltire grandi quantità di fenilalanina. Recentemente, van Spronsen et al. (34) hanno sottolineato un potenziale problema metodologico con il metodo usato da Thompson e collaboratori.
In sintesi, i risultati quantitativi ottenuti con il modello per il metabolismo dell’IPA sono coerenti con i dati che riflettono indirettamente l’attività in vivo dell’IPA, come i livelli di fenilalanina nel sangue allo stato stazionario, i tassi di eliminazione (convenzionalmente espressi come valori t1/2) della fenilalanina dal sangue dopo un carico di fenilalanina e la tolleranza alimentare alla fenilalanina. Il modello ha il potenziale per stimare quantitativamente l’attività IPA residua da uno qualsiasi di questi valori, in particolare dai tassi misurati di clearance di un carico di fenilalanina. I livelli di IPA residui previsti o i valori da essi derivati possono essere utili per decidere quanto rigorosa debba essere la restrizione alimentare della fenilalanina per ottenere il livello di fenilalanina nel sangue desiderato. La tabella 1 riassume i valori t1/2 e i livelli di fenilalanina nel sangue allo stato stazionario calcolati dall’Eq. 3 (supponendo nessuna assunzione di fenilalanina durante il periodo di prova) per diversi livelli di attività IPA residua, nonché i valori comparabili dai dati clinici pertinenti.
- View inline
- View popup
Steady-state phenylalanine blood levels and t
values for clearance of phenylalnine calculated from Eq. 3 per vari livelli di IPA
Note
-
↵* A cui vanno indirizzate le richieste di ristampa. e-mail: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABBREVIATIONS
PAH, fenilalanina idrossilasi; PKU, fenilchetonuria; HPA, iperfenilalaninemia; PAG, fenilacetilglutamina