Nonostante la produzione di livelli significativi di fosfato nei nostri saggi, tuttavia, non siamo stati in grado di rilevare né il consumo di O2 (per mezzo di misure sensibili dell’elettrodo O2) né la produzione di H2O2 (per mezzo di un saggio sensibile di perossidasi di rafano). Inoltre, l’ossidazione del Pt è stata osservata a tassi simili in condizioni strettamente anaerobiche in saggi che includevano solo BAP, Pt e acqua. Questi dati hanno fortemente suggerito che i protoni derivati dall’acqua sono l’accettore di elettroni mancante per la reazione di ossidazione del Pt e che l’altro prodotto della reazione era probabilmente H2 molecolare, secondo l’Eq. 2. A sostegno di questa ipotesi, abbiamo rilevato la produzione di H2 dipendente dal Pt sia in vitro che in vivo. I saggi in vitro sono stati condotti aerobicamente in fiale sigillate utilizzando BAP altamente purificato. Dopo l’incubazione, lo spazio di testa è stato analizzato per H2, e la porzione acquosa è stata analizzata per il fosfato. Come mostrato in Fig. 2B, quantità stechiometriche di fosfato e H2 sono stati prodotti da Pt in presenza di BAP, mentre né fosfato né H2 è stato prodotto in reazioni di controllo contenenti o BAP o Pt da solo.

La misurazione dell’H2 in vivo è complicata dal fatto che E. coli ha molteplici idrogenasi che possono sia produrre che consumare H2. Per aggirare questo problema, abbiamo costruito un mutante ΔhypABCDE, che non può produrre alcuna idrogenasi attiva a causa della sua incapacità di maturare le proteine precursori (32). Il mutante hyp, coltivato aerobicamente in tubi sigillati, ha anche prodotto approssimativamente quantità stechiometriche di H2 in colture coltivate con livelli limitanti di Pt, mentre nessun H2 è stato rilevato in colture coltivate con livelli limitanti di fosfato o dell’estere fosfato fosfoserina (Fig. 2B ).

L’ossidazione del Pt non è una caratteristica comune a tutte le fosfatasi alcaline. L’efficiente ossidazione del Pt sembra essere una caratteristica unica della fosfatasi alcalina di E. coli. Né Bacillus subtilis, che è noto per produrre più fosfatasi altamente attive (33), né P. stutzeri, che è noto per produrre una fosfatasi distinta da BAP (in ceppi che mancano del sistema deidrogenasi Pt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, e W.W.M., dati non pubblicati), può utilizzare Pt come unica fonte P (Fig. 3A ), anche se entrambi gli organismi crescono su supporti con fosfoserina come unica fonte P (dati non mostrati). Così, le fosfatasi prodotte da questi organismi sono incapaci di ossidare Pt a tassi che sono sufficienti per sostenere la crescita. Abbiamo anche testato preparazioni commerciali di fosfatasi intestinale di vitello (CIP) e fosfatasi alcalina di gambero (SAP) per la loro capacità di produrre fosfato da Pt (Fig. 3B). Anche se piccole quantità di fosfato sono state prodotte dalle fosfatasi eucariotiche dopo un’incubazione notturna, solo E. coli BAP è stato in grado di catalizzare la reazione a tassi significativi. Questo risultato è particolarmente sorprendente perché gli enzimi eucarioti sono in realtà fosfatasi molto migliori, con attività specifiche fino a 40 volte superiori al BAP (27). Questi enzimi condividono tutti una significativa omologia (25-35% di identità) con il BAP di E. coli; inoltre, la maggior parte dei residui del sito attivo, incluso il Ser-102 (che forma un intermedio covalente fosfo-enzimatico durante la reazione di fosfatasi), sono conservati (27).

Sembra plausibile che l’ossidazione di Pt sia catalizzata da BAP con un meccanismo simile a quello utilizzato per l’idrolisi dell’estere fosfato (Fig. 4A). Di conseguenza, il Pt può essere idrolizzato dal BAP con l’anione idruro come gruppo di partenza formale. A sostegno di questa idea, un mutante phoA con il residuo Ser-102 del sito attivo cambiato in alanina non è in grado di utilizzare Pt come unica fonte di P, indicando che questo amminoacido è richiesto per l’idrolisi degli esteri fosforici (27) e per l’ossidazione di Pt (Fig. 4B). Anche se il trasferimento diretto di idruro da un substrato a un protone acquoso è biochimicamente senza precedenti, questa reazione è termodinamicamente ragionevole dato il forte potenziale di riduzione della coppia fosfato-Pt (E o′ = -0,650 V). Così, la reazione di produzione di H abbastanza favorevole: ΔG o′ = -46.3 kJ/mol (calcolato dai potenziali redox in rif. 34). Se il modello idrolitico per l’ossidazione del Pt si rivelasse corretto, sarebbe una reazione enzimatica molto insolita. Gli studi hanno dimostrato che BAP è anche in grado di idrolizzare fosfodiesteri (35), fosfoamidi (36), esteri di solfato (37), e tiofosfato (38). Tuttavia, queste reazioni avvengono a tassi che sono considerevolmente più lenti di quelli della reazione di idrolisi del Pt, nonostante il fatto che coinvolgano gruppi di partenza molto migliori. Inoltre, non sono reazioni redox. La reazione analoga che coinvolge l’idrolisi degli acidi alchilfosfonici non è catalizzata dal BAP, come dimostrato sia biochimicamente (39) che dall’incapacità dei ceppi Δphn di usare questi composti come uniche fonti di P (13).

Pt deidrogenasi (PtxD) era stato l’unico enzima caratterizzato in vitro a catalizzare l’ossidazione del Pt (11). Anche se i dettagli della reazione BAP devono ancora essere chiariti, i meccanismi chimici dei due enzimi sono chiaramente distinti. Mentre PtxD richiede NAD come accettore di elettroni per la reazione redox, la reazione catalizzata da BAP non richiede accettori di elettroni esogeni ma sfrutta la grande forza motrice termodinamica della reazione per produrre un prodotto altamente ridotto (H2) da acqua in una reazione essenzialmente irreversibile (K eq calcolato = 1,1 × 108). Tutte le altre reazioni note che producono H2 operano molto più vicino all’equilibrio chimico e sono tipicamente reversibili. Inoltre, tutte le altre idrogenasi conosciute contengono Fe o Ni, o entrambi, nei loro siti attivi (40). Questa osservazione include la cosiddetta “metal-free” H2-forming methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase degli archaea metanogenici, che ora è noto contenere anche Fe (41). Al contrario, BAP non contiene metalli redox attivi, anche se sia Zn che Mg sono necessari per l’attività idrolitica (27). Il trattamento del BAP con chelanti inibisce l’ossidazione del Pt, suggerendo che i metalli giocano un ruolo nella reazione del Pt (dati non mostrati).

Infine, i dati in vivo presentati qui suggeriscono che la reazione di ossidazione del Pt è biologicamente rilevante. L’osservazione che molti batteri possiedono enzimi dedicati all’ossidazione del Pt dimostra che il tratto è sotto forte pressione selettiva nelle popolazioni microbiche (4, 5, 9, 42). Con questo fatto in mente, è interessante notare che sebbene gli enzimi eucariotici siano fosfatasi molto migliori, sono incapaci di ossidare il Pt. Questa osservazione solleva la possibilità che il BAP di E. coli non si sia evoluto per essere la fosfatasi più efficiente, ma piuttosto per essere una fosfatasi con la capacità di idrolizzare il Pt. Questa idea è coerente con la curiosa osservazione che la BAP di E. coli è molto espressa (fino al 6% della proteina cellulare totale) in condizioni di fame di fosfati (28). La spiegazione tradizionale di questo fenomeno è che qualche substrato sconosciuto BAP deve essere scarsamente idrolizzato e, quindi, richiede massicce quantità di enzima per sostenere tassi di crescita competitivi. Tuttavia, poiché c’è poca differenza nei tassi misurati di idrolisi per un’ampia varietà di substrati di esteri fosforici (39, 43), sembra improbabile che questo substrato povero possa essere un estere fosforico. Al contrario, il tasso di idrolisi del Pt è sostanzialmente inferiore al tasso di idrolisi dell’estere fosfato, suggerendo che il Pt può essere il substrato che spiega l’estremo livello di espressione di phoA osservato in E. coli affamati di fosfato.

Chiaramente, molti dettagli della reazione BAP con Pt rimangono da chiarire. Un ulteriore studio di questa reazione unica è probabile che contribuisca non solo alla nostra comprensione della chimica redox del P e delle reazioni di trasferimento del fosforile, ma anche alla nostra conoscenza del trasferimento di idruri, delle reazioni che producono H2 e del ruolo dei composti ridotti del P in natura.

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