Abstract
ヒトのフェニルアラニン代謝の定量モデルの導出を説明した。 このモデルは，純粋な組換えヒトフェニルアラニン水酸化酵素の速度論的特性と，生体内のフェニルアラニンのトランスアミノ化と蛋白分解の速度の推定値に基づいている。 血中フェニルアラニン濃度の定常状態、アミノ酸を経口投与した後の血中フェニルアラニンのクリアランス率、フェニルアラニンの食事耐性についての計算値はすべて、正常者、フェニルケトン尿症患者および偏性ヘテロ接合体のデータとよく一致している。
フェニルアラニンのCO2と水への完全な異化における最初の、そして律速段階は、チロシンへの水酸化で、その反応はフェニルアラニン水酸化系によって触媒される。 このシステムは複雑で、フェニルアラニン水酸化酵素（PAH）、プテリン補酵素テトラヒドロビオプテリン（BH4）、およびBH4を再生する役割を持ついくつかの酵素、すなわち
フェニルアラニンのベンゼン環は、パラ位を水酸化しないと切断されないが、アミノ酸のアラニン側鎖は、環水酸化のステップがなくても代謝されることが可能である。 この経路は、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸へのトランスアミノ化によって開始され、その後、フェニル乳酸、フェニル酢酸、o-ヒドロキシフェニル酢酸などの代謝物へと変換される。 トランスアミナーゼ経路の生成物は尿中に排泄される。 これらのフェニルアラニン代謝の代替経路のステップを図1に概説する。
最初に、このような分析を行う以前の試みは、ヒトPAHおよびヒトフェニルアラニントランスアミナーゼの動力学的特性に関するデータがないために障害となったことを指摘しておく。 実際、後者の酵素については、生体内でこの活性を担っているのが誰なのかさえ、確実には分かっていなかった。 フェニルアラニンがミトコンドリアのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの優れた基質であることがin vitroの証拠で示されたので、これが関与するトランスアミナーゼであると推測されたのである。 さらに、ヒトの対応する酵素の性質が不明であったため、対応するラットの酵素の動力学的性質を用いた(12)。 今回の解析でヒトのトランスアミナーゼの問題がどのように扱われたかは後述する。
組換えヒトPAHの動力学的性質は現在入手可能である(16, 17)。 PAHの動力学は、フェニルアラニンが酵素の基質としてだけでなく、活性化剤としても機能するという事実によって、いくらか複雑になっている（文献1およびその中の参考文献を参照）。 以前、触媒部位と調節部位の両方にフェニルアラニンが規則正しく結合する2サイトモデルに基づいてPAHの動力学的挙動を解析したところ、この酵素の動力学的挙動の多くの特異な側面を十分に説明できたので (18) 、今回の解析でも同様の2サイト、規則正しく結合するモデルを使用することとした。 実際に使用した速度式(19)を式2に示す。ここで、KmはPAHを様々な濃度のフェニルアラニンとプレインキュベーションした実験において、半速を与えるフェニルアラニンの濃度、Kaは半活性化を与えるフェニルアラニンの濃度である。 今回の解析では、BH4を補酵素として37℃で純粋な組換えヒトPAHを用いて決定した以下の速度定数を使用した。 フェニルアラニンのKmは0.51 mM、活性化剤としてのフェニルアラニンのKaは0.54 mMである（D. Kowlessur and S.K., unpublished data）。 ヒトPAH(16)のVmaxの近似値（おそらく過小評価）は、血清フェニルアラニン値を≈17倍増加させるのに十分なl-フェニルアラニンを経口投与した後の対照被験者の血清フェニルアラニン値の初期減少速度（0.9μmol/ml/h）から計算された(20)。 
2 上記のように、フェニルアラニンのトランスアミノ化に関与するヒトの酵素の同定という以前の問題は、今回の分析では迂回された。 古典的なPKU患者におけるフェニルアラニンの純廃棄の主要な経路はトランスアミノ化であると仮定したのである。 例えば、すでに述べたように、フェニルアラニンの尿中排泄量はトランスアミノされる量の≈11%に過ぎず、生後1年の終わりまでに、タンパク質への取り込みによって処分されるフェニルアラニンの量はトランスアミノによって処分される量の≈25%に過ぎないと推定することができる。 フェニルアラニンの血中クリアランスからトランスアミナーゼ活性を推定する本法では、尿中への排泄やタンパク質への取り込みといった軽微なフェニルアラニンの処理反応もトランスアミナーゼ活性の推定に含まれるため、この活性が若干過大評価されることに注意すべきである
本解析に用いるにはトランスアミナーゼのKmとVmaxが必要である。 古典的なPKU患者に対して行われたフェニルアラニン負荷試験の結果から、フェニルアラニンのトランスアミナーゼのKm値を抽出する試みが行われた(21)。 ヒトのトランスアミノ化酵素のVmaxの値を推定するために採用された方法は、古典的PKU患者のグループが排泄したすべてのトランスアミノ化由来の代謝物（すなわち、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸およびo-ヒドロキシフェニル酢酸）の合計を血漿フェニルアラニン濃度の関数として表したデータを用いることであった。 mmol/molクレアチニンとして表される最大排泄量は1,370であり、このレベルは血漿フェニルアラニン値が1,200～2,400μmol/リットルの間でプラトーになると思われた(22)
この値をトランスラミネーションの速度に転換しようとすると、研究に使われた患者サンプルの年齢範囲が2歳から18歳と広いので複雑である。 本解析では、患者の平均体重を50kgとし、1日のクレアチニン排泄量を2g/24hと仮定した(23)。 さらに、トランスアミナーゼ由来の代謝物の排泄は、24時間の間に直線的な速度で起こり、これらの代謝物の生成速度を反映するものと仮定した。 また、これらの化合物は、密な軟骨結合組織と骨を除くすべての体液区画と平衡すると仮定し、これらは合わせて全体水の15％を占め（24）、アクセス可能な水の分布量は500 ml/kg体重となった。 これらの仮定に基づいて、トランスアミネーションの最大速度は、0.043μmol/ml/hと計算された。
Langenbeckら（22）の研究で測定されなかったフェニルピルビン酸から少なくとも一部派生するフェニルアラニン代謝の追加産物は、フェニルアセチルグルタミン（PAG）である。 PAGは、フェニルピルビン酸から酸化的脱炭酸によって得られるフェニル酢酸から形成され得るという証拠がある(25)。 また、フェニルアラニンから、トランスアミノ化ではなく、フェニルエチルアミンへの脱炭酸とフェニルアセテートへのアミン酸化によってフェニルアセテート、ひいてはPAGが生成することも提案されている(26)。 しかし、PKU患者において、アミン酸化酵素の阻害剤を投与してアミンの酸化を阻害しても、排泄されるフェニルエチルアミン量が少ないという知見は、先に述べたように（12）、フェニルアラニンの脱炭酸は、PAG形成と同様にフェニルアラニン代謝の量的にマイナーな経路であることを示唆している。
健常者のPAGの排泄量は250～500mg/日であるが、PKU患者はその2倍の量を排泄している(28)。 トランスアミナーゼ経路で生成されるPAGの量を計算するために、患者が排泄する「余分な」量だけがフェニルピルビン酸に由来するという保守的な仮定がなされた。 排泄されるPAGの平均的な余分な量を350mg/日とし、上記の同じ仮定をすると、この排泄はPAGの形成速度を0.020μmol/ml/hと換算し、すべてのトランスアミナーゼ生成物の形成速度を0.063μmol/ml/hとする
Vmaxにこの値を用いて、従来のPKU患者に行われたフェニルアラニン負荷テストの結果（21）から、1.
本解析では、PAHとトランスアミナーゼ活性は血中フェニルアラニンレベルの関数として計算されるため、これらのレベルがアミノ酸の組織レベルを反映していることが重要である。 この点に関連して、PKU患者の肝臓組織（29）、高フェニルアラニン血症ラットの肝臓および腎臓組織（30）のフェニルアラニン濃度は、対応する血中濃度と同程度であることが報告されている。
式2の第3項である正味のタンパク質分解速度は、WaterlowとJacksonのデータから推定されたもので、フェニルアラニン負荷試験を行う状態である空腹時に、正味のタンパク質分解（すなわち。 は、12 時間で 0.30 g/kg 体重に相当する。 骨格筋は体格の≒40%を占め(24)、この組織におけるタンパク質の異化は、末梢へのアミノ酸の供給に大きな役割を果たしているので、骨格筋におけるタンパク質分解は、絶食中に起こるタンパク質の分解のうち優勢な事象とした。
ヒト骨格筋には≈46 μmol フェニルアラニン/g 組織(32)が含まれている。 この値と、成人のヒトの筋肉は19.8％のタンパク質を含んでいる（33）という知見に基づいて、筋肉は232μmol phenylalanine/gの筋肉タンパク質を含んでいると推定される。 この値を体内タンパク質貯蔵量の代表とすると、12時間あたり≈70μmol phenylalanine/kg body weightが空腹時に遊離されることになる。 フェニルアラニンのトランスアミンの速度を推定する際に行ったのと同じ仮定に基づいて、最後の値は、1時間当たり0.012μmol/mlの正味タンパク質分解速度（およびこのプロセスからのフェニルアラニンの放出）に変換される。この反応の基質、すなわちタンパク質の身体貯蔵物は、おそらく短い空腹期間中比較的一定のままなので、タンパク質分解は0次動力学に従うと仮定された。
式1に示した3つの反応の動力学定数の推定値を代入すると、式3が得られる： 
3
結果および考察
式3の一般的妥当性はいくつかの方法で評価することが可能だ。 まず、式に示した速度定数を含むPAH触媒反応の速度の式を用いると、水酸化反応の基底速度は0.010μmol/ml/hと算出された。 この値は、健常者にl-フェニルアラニンを投与した実験に基づいて報告された次の値とよく一致する：0.013μmol/ml/h; 0.008μmol/ml per h (34); 0.012μmol/ml per h (5); 0.010μmol/ml per h (6)． 被験者にl-フェニルアラニンを注入した最後の研究では、0.020μmol/ml/hという値が見いだされた(6)。 フェニルアラニンからチロシンへの生体内変換率は、いずれも1kgあたりμmol/hと報告されている。 フェニルアラニンなどの代謝物の体積分布が500ml/kg体重であるという、以前と同じ仮定に基づいて、μmol/ml per hに換算した。 これらの結果は、計算されたフェニルアラニン水酸化速度は実験的に決定された速度とよく一致することを示している。
モデルの妥当性のもう一つのテストは、対照被験者と正常PAH活性の50％と推定されるPKUヘテロ接合体の両方について、定常状態の血液フェニルアラニンレベルと、フェニルアラニンの負荷のクリアランスのt1/2を計算することである（すなわち、, フェニルアラニンの初期濃度が1/2まで減少するのに必要な時間）と、これら2つのグループの血中フェニルアラニン負荷のクリアランスのt1/2。 式3（-dPhe/dtを0とし、フェニルアラニン濃度を計算）から算出されるコントロールの定常フェニルアラニン濃度は0.059 mM、PAH活性残存率50％の被験者のそれは0.079 mMでコントロールより1.34倍高いことが分かった。 健常者の0.059 mMという値は、0.058 ± 0.015 mM（平均値と標準偏差）(35)という一般的な値とよく一致するが、PAH活性が正常値の50％と予想される異型接合体の0.079 mMという値は低すぎるように思われる。 対照群と義務的PKUヘテロ接合体の血中フェニルアラニン濃度の比は、モデルで予測された1.34ではなく、1.57-1.61の範囲であることが報告されている（36-38）＜1044＞＜8557＞この計算値は、PKUヘテロ接合体が対照群のPAH活性の50％未満であるかもしれないという可能性を提起している。 ヘテロ接合体の対照PAH活性の40%という値を式3に代入すると、0.093 mMの定常状態のフェニルアラニン濃度が得られる。この値と対照の0.058 mMという値を使用すると、1.60の比率が得られ、これはヘテロ接合体と対照について報告した範囲（上述）とほぼ同じである。 この点で、6人のHPA偏性ヘテロ接合体について見つかった肝生検試料中の残留PAH活性は、対照値の5.8〜31％の範囲であったことに注目すべきである(39)。 これらの結果は、HPAヘテロ接合体の活性が対照値の50％よりかなり低いことを初めて示すものであった。 PKU患者の両親を対象としたその後の2つの大規模な研究でも、これらの初期の結果と一致していた。1つの研究では、平均値が対照値の29.3% (n = 9) (40)、別の研究では平均値28.1% (n = 8) (41)と報告している。
モデルはまた、実際の臨床結果と一致している、正常者とヘテロ接合体の両方の血液からフェニルアラニンを除去するt1/2の値についても予測している。 正常者では65分となり、報告されている平均値89分より低いが、60〜120分の範囲内である(10)。 ヘテロ接合体の場合、PAH活性が50%と40%残存しており、式3から計算されるt1/2値は、報告されている平均値159分に対し、それぞれ144分と180分であった
先に、フェニルアラニン代謝ができないのはトランスアミナーゼ欠損の結果と思われるHPA患者2人の報告（11）とこの結論に対する証拠を参照した（12）。 今回のモデルは、この主張に対して懐疑的な見方を示す新たな根拠を与えるものである。 Fig. 2は1mMのフェニルアラニンが血漿から消失する時間経過を対照群（曲線A）とトランスアミナーゼを欠くがPAHが正常な人（曲線B）の血漿から示したものである。 このように、両者はほとんど同じ速度であり、トランスアミナーゼの欠如によって顕著なHPAが引き起こされる可能性は極めて低い。 このように両者がほぼ一致するのは、PAHが全くない場合（曲線D）のフェニルアラニンの消失速度が非常に小さく、初期速度が正常なPAHレベルのコントロールのわずか2.6％であるためである。 図2（曲線C）はまた、PAHが正常値の40％である個体におけるフェニルアラニンの消失率を示しているが、このPAH活性の欠損は、上述のように、PKUヘテロ接合体の平均を表していると思われる。
コントロールと異なる遺伝子型を持つ個人のフェニルアラニンの負荷のクリアランスの計算された速度。 A、コントロール；B、トランスアミナーゼ活性がゼロの被験者；C、コントロールPAH活性の40％の被験者；D、コントロールPAH活性の0％の被験者
最近、PKU患者は、食事フェニルアラニン耐性に基づいて表現型のカテゴリーに割り当てることによって分類されている。 古典的PKUの患者は血中フェニルアラニン値を許容値である0.3mMに維持するために1日20mg/kg以下のフェニルアラニンを許容し、「中程度PKU」の患者は1日20～25mg/kg、「軽度PKU」の患者は1日25～50mg/kgを許容しています（42）。
これらの食事性フェニルアラニン許容値が式3による予測と一致するかどうかを見るために、許容量のフェニルアラニンの摂取を3回の “食事 “に等分することを仮定した。 フェニルアラニンの摂取量が1日あたり15 mg/kgの古典的PKU患者の場合、各食事は1日あたり5 mg/kgを含み、0.30 μmol/mlの基準値に対して0.06 μmol/mlを加え、総血漿フェニルアラニン値は0.30 + 0.06 = 0.36 μmol/mlとなる。 この値を式3に代入すると（古典的PKU患者のVmaxはゼロに等しいと仮定）、-dPhe/dtは1時間当たり0.001μmol/mlに等しく、すなわち、このレベルのフェニルアラニンでは、トランスアミノ反応を通じたフェニルアラニンの消失速度が、純蛋白分解による血漿プールへの流入速度をぎりぎり上回る程度である。 したがって、式3は、これらのPKU患者が1日当たり15 mg/kgのフェニルアラニン摂取に耐えられることを予測する。
同じ方法で計算すると、1日当たり25 mg/kgの食事性フェニルアラニン耐性を持つ「中等度PKU」患者は、3日間でそれを代謝するには野生型の15％に相当する残留PAH活性が必要である。同様に、フェニルアラニン耐性が1日50 mg/kgの「軽度PKU」患者では、添加したフェニルアラニンを約3時間で代謝するには、野生型の25%の残留PAHレベルが必要である。これらの結果は、式3がこれらの異なる患者群に見られる食事性フェニルアラニンの耐性を説明できることを示している。
「軽度PKU」および「中度PKU」患者の残留PAH活性のこれらの推定値と、患者が保有する変異PAH種についてin vitroで測定した残留水酸化酵素活性の相関を試みることが有用であると思われる。 しかし、現時点では、in vitroのデータにはばらつきがありすぎるため、このような試みは困難である。 したがって、「中等度PKU」(42)と分類される数人の患者は、次の3つの変異型PAHを保有していることが示されている（in vitroでの残留PAH活性は、野生型活性に対する割合として括弧内に表示されている）。 L348V (25%), R261Q (30%, 47%), および R158Q (10%) (43)。 これらの値はほぼ5倍も異なっていることがわかる。 先に述べたように(2, 43)、一般にPAH変異体の残存ヒドロキシラーゼ活性のin vitroでの推定値は肝生検で観察される値よりも高くなる傾向がある。 この傾向の少なくとも1つの理由は、変異体R261Qで行われたように、in vitroのPAH活性は慣習的に飽和濃度のフェニルアラニンとBH4を用いて測定されるからである(44)。 このような状況を考えると、式3を用いて推定された残留PAH活性は、in vitroで測定されたものよりもin vivoでの活性をよく反映している可能性がある。
現在のフェニルアラニン代謝のモデルは、Thompsonと彼の同僚(45、46)が、重水素ラベルしたフェニルアラニンとチロシンを患者に注入して得られた結果に基づいて出した結論と関連しているが、古典的PKU患者では対照患者の76％に相当する「かなりの」PAH活性を持っていると言う。 この驚くべき高いフェニルアラニン水酸化活性は、チロシン水酸化酵素に起因するものである(45)。 すでに述べたように、Fig.2に要約した結果は、PAHがない場合、一回分のフェニルアラニンが血液から排出される速度は、コントロールで見られる速度の3％未満であることを示している。 今回の分析からは、大量のフェニルアラニンを処理できる代替経路がヒトに存在することを示すものはない。 最近、van Spronsenら(34)は、Thompsonらが用いた方法の方法論的問題の可能性を指摘している。
まとめると、PAH代謝のモデルで得られた定量結果は、PAHの生体内活動を間接的に反映するデータ、例えば定常状態の血中フェニルアラニン濃度、フェニルアラニン負荷後の血液中からのフェニルアラミンのクリアランス率（従来t1/2の数値で表される）およびフェニルアラニンに対する食事耐性を首尾よく表している。 このモデルは、これらの値、特にフェニルアラニン負荷のクリアランスの測定速度から、残留PAH活性を定量的に推定する可能性を持っている。 予測された残留PAHレベルまたはそれから得られる値は、望ましい血中フェニルアラニンレベルを達成するために、フェニルアラニンの食事制限をどれだけ厳しくしなければならないかについての決定をする際に有用であろう。 表1は、異なるレベルの残留PAH活性について、式3（試験期間中にフェニルアラニンを摂取しないと仮定）から計算したt1/2値と定常状態の血中フェニルアラニンレベル、および関連する臨床データからの比較値をまとめたものである。
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Steady-state phenylalanine blood levels and t
Eq.3 から計算したフェニルアルニンのクリアランスに対する値（テスト期間中にフェニルアラニンを摂取しないと仮定）。 3を様々なレベルのPAH
脚注
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↵*転載先: kaufman{at}codon.nih.gov.Tel.
ABBREVIATIONS
PAH, phenylalanine hydroxylase; PKU, phenylketonuria; HPA, hyperphenylalaninemia; PAG, phenylacetylglutamine