要旨
本研究では、南米ナマズRhamdia quelenの膵島分泌細胞の超微細構造を詳細に説明することができた。 α顆粒は電子密度や溶解度の異なる中央部と外周部からなること、δ細胞は形態的には変化しているが生存可能なα細胞である可能性が高いこと、β顆粒はおそらく繰り返し部分構造を持ち、したがってインスリンの細胞内結晶貯蔵形態である可能性を支持する証拠が提供された
1. はじめに
ランゲルハンス島は1869年にLangerhansによってウサギで発見された。 しかし、その約20年前にStanniusとBlockmannによってテレオスで報告されていたため、頻度は少ないがStannius小体、Blockmann小体と呼ばれることもある。 ランゲルハンス島は内胚葉由来で、ほとんどのテレオストでは膵臓の外分泌部分に散在する小体として見られる。
魚には個別の膵臓はない。 外分泌の膵臓組織は腸管に沿って散在しているのが見受けられる。 外分泌膵臓の腺構造は哺乳類のものと非常によく似ており、非常に暗い好塩基性の細胞質を持つ細胞から構成されている 。 活発に餌を食べる魚では、それらは多数の明るい好酸性の分泌顆粒を含んでいる。 ランゲルハンス内分泌膵島は、α細胞（グルカゴン様ペプチド産生）、β細胞（インスリン産生）、d細胞（ソマトスタチン産生）を含む組織であり、区別することができる。 哺乳類とヒトでは、ヒトの成体膵島に関する初期の電子顕微鏡による記述はほとんどが簡潔で、出版物のごく一部は主にβ細胞腫瘍の記述や、いくつかの種の膵島の比較形態を論じた調査論文に費やされている
魚類の膵臓は電子顕微鏡研究のための組織源としてすぐに証明できないことが多い。 魚類の主膵臓は解剖学的にも発生学的にも哺乳類の膵臓に似ているが、他の魚種では大きな違いが見られる。 ゼブラフィッシュの成体では、主膵臓は外分泌組織に囲まれたいくつかの主要な膵島を含む。 膵外分泌組織と脂肪に囲まれた単一膵島の尾部が腸に沿って尾方に伸びている。 一方、グルコースに敏感な魚であるティラピアのβ細胞は、腸間膜にあるランゲルハンス島に存在し、膵外分泌組織に囲まれていない。 Rhamdia quelenはテレオスト種であり、亜熱帯気候の養殖に重要な種である。 本研究では、ランゲルハンス島の超微細構造を解析し、南米産ナマズのさまざまなタイプの分泌細胞について詳細に説明した。 quelen.
2.材料と方法
アルゼンチン北東部のCentro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) から養殖のR. quelem雌2匹と雄2匹（g；cm）、200Lタンクにストックし、解剖前に2週間馴化させた。 飼育には、25℃、水交換率100%の濾過淡水を使用した。 日照時間は12時間暗黒、12時間明期に調整した。 餌は市販の飼料（Ganave）を1日4回手渡しで与えた。 魚はベンゾカイン（500ppm）で安楽死させ、剖検し、腸に沿って尾側に伸びる脂肪のサンプルを10％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込み、ヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色した
組織の小片を1mmブロックに切り、直ちにリン酸緩衝グルタルアルデヒドで固定（pH6.9、4℃）で固定し、ミロニッヒ溶液で洗浄し、1％四酸化オスミウムで後固定した。次に、組織ブロックをエタノール-アセトンの段階的シリーズで脱水し、酸化プロピレンに浸し、Durcupan ACNI（フルカケミー A.G.., Switzerland)に埋め込んだ。 薄切片はLKBウルトラミクロトームで切断し，酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色してからJeol JEM-8T 電子顕微鏡 (Jeol, Tokyo, Japan) で検査した． 光顕微鏡観察
R. quelenは総胆管周囲の脂肪組織中に膵臓が散在しており、これは上部を胃、前部を肝臓、下部を脾臓と胆嚢で囲まれたほぼ三角形の領域内に位置しています。 各ランゲルハンス島は、外分泌膵臓に囲まれた比較的純粋な島組織からなる（図1）。 男女差は認められなかった。
図1
3・2． Electron Microscopy
通常膵島の内部を占めるβ細胞は、外分泌膵臓から周辺部に位置するα細胞によって分離されているのが普通であったが、必ずしもそうではなかった（図2）。 β細胞の超微細構造は、4魚種とも同じであった。 特徴的なβ顆粒は平滑膜の嚢に含まれ、大きさと形は様々であった。 結晶は長方形、正方形、六角形、不規則な多角形が見られた。 丸いものもあるが、頻度は低い（図2〜5）。 各顆粒は、大きさや形が異なる1つまたはいくつかの結晶または非構造体から構成されていた。 固定剤の選択は、β顆粒の内部構造に影響を与えないようであった。 包膜の範囲内では、使用した固定剤にかかわらず、結晶の周辺領域は空であるか、微細な凝集性沈殿を含んでいるように見えた。 高倍率で見ると、断面に対して適切な向きにある結晶には、繰り返し部分構造が見えることがあった（図6、7）。 多数のミトコンドリアは細胞全体に分散しており、丸みを帯びた、あるいはふっくらとした糸状構造として見えた。 これらはβ細胞のものよりも大きく、数も多かったが、通常は膵臓のアシナー細胞のものよりも小さかった。 多数のミトコンドリア・クリストは、ほとんどの場合、横方向に向いており、ミトコンドリア顆粒は存在するが、顕著ではない。 顆粒小胞のシスターンは通常、短いか小胞状であった（図2〜4）。 顆粒状小胞体と遊離リボソームは、アシナール細胞やβ細胞ほどβ細胞の特徴として顕著ではなかった。 図2
アルデヒド固定後のゴルジ体複合体はより顕著で、構成構造もより拡張していた（図2）。 これらの固定剤を使用した後，ゴルジ小胞内に密な非晶質物質が時折認められ，未熟な顆粒あるいはβ分泌顆粒の前駆体であると思われた． β細胞核は通常球状で、輪郭は比較的滑らかであった。 隣接する膵島細胞の細胞膜はデスモソームによって結合されていることは少ないが，密着している． 3個以上の細胞の接合部では，境界膜はしばしば蛇行し，細胞間結合が見られた（図2，図9）。 ほとんどのβ細胞で、セロイドに似た多胞性細胞質包有物が目立っていた（図2、7、9、8）。 これらの包有物の出現と頻度は、固定剤としてオスミウム酸やアルデヒドを一次的に使用しても大きな影響を受けず、これらの顆粒の存在と細胞による生理的活動の形態的証拠との間には明白な関係はなかった。 α-細胞の超微細構造は4つの組織試料すべてで同じであった。 これらの細胞の大きさ、形、核は、正常なβ細胞のものと大きな違いはなかった（図2、7）。 核の形が不規則であったり、へこんだりしているα細胞も見られるが、鑑別の基準となるほどの頻度ではない。 α細胞の細胞質顆粒は、オスミウム一次固定により、大きさの異なる密な球状体として保存され、緩くフィットする平膜の袋の中に含まれていた（図7、9）。 これらはβ顆粒よりは大きいが、アシナール細胞の酵素原顆粒よりはかなり小さい（図2）。 細長いミトコンドリアはβ細胞より小さく、数は中程度で、クリステーが横向きに付いていた。 粒状小胞体はしばしば円柱状で、β細胞よりも豊富であった（図9）。 ゴルジ体が見える場合は、その割合は中程度であった。 ゴルジ小胞やシステイン内の密な非晶質物質（おそらく分泌顆粒の前駆体）は、β細胞よりもα細胞でより一般的であった（Figure 10）。 セロイド小体は、よく見えるものの、β細胞よりも少なかった（図2、3）。 したがって、α顆粒が位置する袋は完全に満たされているように見え、顆粒は丸みを帯びた内側の高密度のコアと、オスミウム固定後には存在しない外側の電子密度の低いマントルからなり（図3および9）、したがっておそらくより可溶性が高いと結論された。 α顆粒の内側にも周辺部にも、一貫した下部構造は見られなかった。 また、α-細胞とβ-細胞の間の移行形態と解釈されるような細胞は一度も見られなかった。 α顆粒は、外側と内側の高密度な部分を含めて、全体の大きさは「δ顆粒」と同等であった。 さらに、両方のタイプの顆粒を含む中間細胞が存在することから、δ-細胞は実際には修正されたα-細胞であることが示唆された（図10）。 δ-細胞は、ほとんどα-細胞の間に位置しているが、可視化されており、電子密度が低く、分泌顆粒の全体サイズが大きいことに基づいて、α-細胞と超微細構造的に同定・区別されている。 さらに、両方のタイプの顆粒を含む中間細胞が存在することから、δ-細胞は実際には修正されたα-細胞であることが示唆された（図11）
図7
分泌顆粒の数とゴルジ体および顆粒小胞体の隆起の間には逆の関係があるが，α-あるいはβ-顆粒の放出パターンは観察されなかった． 膵島は通常、薄い基底膜と様々な量の結合組織によって隣接するアシナー細胞から分離されていた（図2）。 しかし、時には膵島とアシナール細胞の間に基底膜が存在せず、狭い間質によってのみ隔てられているものもあった。 柵状の毛細血管内皮細胞は、少なくとも毛細血管基底膜によって、常にそれらと隔てられていた（図9）。 コラーゲンや弾性組織成分など、他の支持要素も存在することがあった。 7996>
4. 考察
魚類のβ細胞は、分泌顆粒の形態によりα細胞と容易に区別される。 角ばったサブユニットが多く存在し，部分構造が繰り返されていることから，β顆粒は結晶性であることが示唆された。 結晶格子の寸法を決定し、測定する試みはまだ成功していない。 ゴルジ体近傍の分泌顆粒を観察したところ、結晶性のサブユニットは通常観察されなかった。 したがって、非結晶顆粒あるいはゴルジ複合体内の非晶質物質は、顆粒の結晶性サブユニットとは異なる化学的あるいは物理的形態のインスリンあるいはインスリンタンパク質複合体を表していると推測することは魅力的である。 β-顆粒内のこれらの異なる形態が異なる溶解度を持ち、おそらく生理的な需要に応じた放出の異なるパターンorateを持つかどうかは不明である。 分泌顆粒は粒状小胞体の小胞や小胞では観察されなかった。 他のタンパク質分泌細胞と同様に、ゴルジ体が小胞体で合成された産物を濃縮あるいは「パッケージ」する機能を果たしているのだと推測される。 分泌顆粒が含まれる平滑膜の袋は、小胞体からではなくゴルジ膜に由来することが論理的に導かれる。
大きく、丸く、密な分泌顆粒を持つα-細胞は、他の種のα-細胞と非常によく似ている。 α-細胞の顆粒の大きさは様々であるが、ほとんどの細胞は異なる大きさの顆粒を取り揃えているようであり、他の種で示唆されているようなこの細胞タイプの下位分類をすることは不可能である。 現時点では、魚類の膵島に「δ-細胞」が存在することを裏付ける生理学的データは発表されていない。 これまでδ細胞の存在は、気まぐれ銀、リンタングステン酸ヘマトキシリンなどの顆粒染色による光学顕微鏡検査や保存状態の悪い組織の電子顕微鏡検査によるデータで、さまざまな主唱者たちによって支持されてきた。 この顕微鏡写真は、1931年にブルームが考え、その後1941年に五森が考えた、δ細胞は変化したα細胞であるかもしれないという意見を支持するものであった。
内側の密度が高く外側の密度が低い典型的なα顆粒から、ほぼ同じ大きさで密度が均一だが減少したδ顆粒への移行は、しばしばミトコンドリア、ゴルジ体、顆粒小胞体の膜成分の形態的完全性や染色強度が徐々に失われることを伴っている。 核は無傷で生存しているように見えるし、少数の遊離リボソームやセロソームも残存していることから、いわゆるδ細胞は、この転移の最終段階、すなわち分泌顆粒自体がもはや見えず、セロイド顆粒とリボソーム以外のすべての細胞質オルガネラが存在しない段階においても、生存していることが示唆される。 δ細胞の機能を示す生理学的データがなく、また別種の細胞であることを示す有力な形態学的証拠もないため、α細胞からδ細胞への移行が、ヒトのブルームの第3の顆粒細胞に関する最も有力な説明として受け入れられることが期待される。 これらの生存しているが変化したα細胞の意義は不明である。 膵島や膵管内にはα細胞やβ細胞が単独あるいは小さな集団で見られるが、中村と横手（4）が示唆したような膵島と膵島、膵管と膵島の中間形態は4つの膵臓試料中では全く見られなかった。
Conflict of Interests
著者らは、本論文の発表に関して利害の衝突がないことを宣言する。
Acknowledgement
L.は、「膵臓は、膵管と膵臓の中間に位置する。 A. Romanoは、ブラジル研究評議会（CNPq）より生産性研究奨学金を受けた（プロセス番号：PQ 301002/2012-6）
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