Results and Discussion
E. coliのPt酸化の2経路． 遺伝子研究により、phnオペロンにコードされるC-Pリアーゼという酵素がPtを酸化する能力があることが示されている(26)。 しかし、最近の研究(9)では、大腸菌のphn変異体の中に、白金を酸化できる株があることに驚かされた。これらの株の遺伝子型を調べると、phoA遺伝子座が白金の酸化に関与している可能性が示唆された。 この仮説を直接検証するために、phn遺伝子座とphoA遺伝子座のみが異なる大腸菌株について、Ptを唯一のP源とする培地で増殖する能力によって、Ptを酸化する能力を調べた。 リン酸塩は生育に必要であるため、生物はPtをリン酸塩に酸化する能力がなければこの培地では生育できない。 phoA +またはphn +のどちらかの遺伝子座に変異がある株は（もう一方の遺伝子座の変異の有無にかかわらず）Pt培地で生育したが、phnとphoAの両方に変異がある株は生育しなかった（Fig.1）。 したがって、大腸菌はPtの酸化にphn依存性とphoA依存性の2つの経路を持つことになる
PhoA依存的Pt酸化欠損変異体の単離と解析…………………………… 大腸菌のphoA遺伝子は、分泌型ペリプラズム酵素BAPをコードしている。 BAPは、大腸菌がリン酸エステルをPの代替供給源として利用することを可能にする非特異的ホスホモノエステラーゼであり、徹底的に研究されている (27, 28)。 BAPの既知の酵素機能と一致して、phoA依存性経路に関する我々の当初の仮説は、Ptはまだ知られていない酵素によってリン酸エステルに酸化され、その後BAPによって加水分解されて成長に必要な自由リン酸が放出されるというものであった。 これらの未知の酵素をコードする遺伝子を同定する試みとして、Δphn株のトランスポゾン誘導変異体（染色体上の非必須遺伝子をすべて飽和させるに十分な数）≒3万個について、唯一のP源として白金を用いることができるかどうかを検討した。 我々は、白金培地での生育が悪い、あるいは全く生育しない22の変異体を単離した。 各変異体のトランスポゾン挿入部位をクローン化し、塩基配列を決定して、Pt表現型の原因遺伝子を同定した。 その結果、phoA（7株）、phoBRオペロン（8株）、dsbA、cpxA、lpp（2株）、ygiT、ygjM、yhjAが特定された。
これらの遺伝子について既知の機能を調べた結果、BAPだけがphoA依存経路でのPt酸化に関わる酵素だという予想外の結論に至った。 従って、phoAとphoBの変異体は表現型的にBAP-である。 PhoR変異体はphoAを構成的に発現するが、リン酸飢餓条件下で野生型に見られるレベルよりはるかに低い(28)。 DsbAはペリプラズムタンパク質のジスルフィド結合の形成を触媒し、完全活性型BAP（二量体あたり4つの必須ジスルフィド結合を含む）の合成に必要であり、一方CpxAはdsbAの転写を正常に制御するのに必要である (29, 30)。 Lpp変異体は、BAPを含むペリプラズムタンパク質を周囲の培地に漏出することが知られており、そのため、野生型株よりもペリプラズムタンパク質のレベルが低くなっている(31)。 他の3つの遺伝子についてはまだ機能が提案されていないが、BAP活性の低下が彼らのPt表現型にも関与している可能性があると思われた。 この可能性を検証するために、遺伝子スクリーニングで同定された各遺伝子の代表的な変異体についてBAP活性を測定した。 ygiT、ygjM、yhjAを含む各変異体は、BAP活性が野生型の6-76%の範囲で低くなった。 さらに、BAP活性のレベルは白金培地で観察される成長のレベルとほぼ相関しており、BAP活性が低いほど白金培地での成長速度は遅かった（PNASのウェブサイトにサポート情報として掲載されている表2を参照）
Pt酸化はBAPにより触媒される。 トランスポゾン誘導変異体を含む遺伝学的アプローチでは必須遺伝子を特定できないため、我々は生化学的戦略も用いて白金のリン酸への酸化に必要なタンパク質を特定した。 高感度マラカイトグリーン色素結合アッセイ（21）を用いて、白金で生育したΔphn大腸菌の抽出液から白金依存的なリン酸生成（すなわち白金の酸化）を検出することができた。 このアッセイを用い、Pt酸化酵素の4段階精製を追跡した。 各段階において、白金酸化活性を有する画分のみが同定され、第4段階の後、染色した変性ポリアクリルアミドゲルの目視検査により≈99%純粋と推定される単一タンパク質から構成されていた。 N末端タンパク質の配列決定により、このタンパク質がphoA遺伝子の産物、すなわちBAPであることが確認された。 最適な条件下で、5つの独立した調製物から高度に精製されたBAPは、62〜242 milliunits/mgの比活性（マラカイトグリーンアッセイによるリン酸生成として測定）でPt酸化を触媒し、41〜61 units/mgの比活性（発色基質p-ニトロフェニル-リン酸で測定）でリン酸エステル加水分解を触媒することが判明した。 興味深いことに、白金酸化反応の至適pHはリン酸エステル加水分解のそれ（pH > 8.5）よりも大幅に低い（文献27およびK.Y. and W.W.M, unpublished data）
Piと分子H2がBAP触媒による白金酸化の生成物であること。 白金のリン酸への酸化は2個の電子を放出する。しかし、上記のアッセイには外来電子受容体は含まれていない。 さらに、FAD、FMN、NAD、NADP、および様々な酸化還元活性色素を含む標準的な電子受容体の添加は、細胞抽出物中のPt酸化を刺激しなかった（データは示されていない）。 この結果についてもっともらしい説明は、Ptが反応中にリン酸に酸化されず、他の還元されたP生成物が色素結合アッセイによって検出されているということであった。 この可能性は、31P核磁気共鳴分光法を用いて除外し、反応中にPiが生成していることを確認した（Fig.2A）。 そこで、式（1）に従って、分子状酸素が電子受容体として欠損している可能性を検討した。 
しかし、我々のアッセイではかなりの量のリン酸が生成されたにもかかわらず、O2 の消費 (高感度 O2 電極測定による) も H2O2 の生成 (高感度西洋わさびペルオキシダーゼ測定による) も検出されなかった。 さらに、BAP、Pt、水のみを含むアッセイでは、厳密に嫌気的な条件下でPtの酸化が同程度の速度で観察された。 これらのデータから、Ptの酸化反応では水由来のプロトンが不足する電子受容体であり、式（2）により、反応のもう一つの生成物はH2分子である可能性が高いことが強く示唆された。 
この仮説を裏付けるように、我々はin vitroとin vivoの両方で白金に依存したH2生成を検出した。 In vitroでは高純度BAPを用い、密閉したバイアル内で好気的に測定した。 インキュベーション後、ヘッドスペースでH2を分析し、水溶液でリン酸塩を分析した。 Fig. 2B に示すように、BAP の存在下で Pt から化学量論的量のリン酸塩と H2 が生成されたが、BAP または Pt 単独を含む対照反応ではリン酸塩も H2 も生成されなかった
BAP触媒による白金酸化の生成物はリン酸塩とH2分子である。(A) プロトン分離31P核磁気共鳴スペクトルとピーク位置は、5mM白金と5mMリン酸のコントロール、および最初に5mM白金と500μg精製BAPを含む一晩反応についてのものである。 酵素反応のスペクトルには、未反応のPtのピークと新しいリン酸のピークが見られるが、他の生成物は生成されなかった。 コントロールとBAP触媒反応生成物の間でリン酸ピークの位置がわずかにずれているのは、わずかなpH差によるものである。アッセイにリン酸ストック溶液を加えると、Piピークの高さは増加するが、余分なピークは生成しなかった。 プロトン結合スペクトルはこの解釈と完全に一致する（データは示していない）。 (B）BAP触媒による白金酸化は、化学量論的な量のリン酸と分子H2を生成する。 表示成分を含むin vitro反応を、密閉したバイアル内で37℃で一晩インキュベートした。 その後、ヘッドスペース雰囲気は熱伝導度検出器付きガスクロマトグラフィーによってH2をアッセイし、一方、水相はマラカイトグリーンアッセイを使用してリン酸塩をアッセイした。 反応（3ml）は、50mM Mops（pH 7.0）に50mM Pt（pH7.0）および387μgの精製BAPを加えて、指示通りに実施した。 BAPまたはPtを単独で含む3連のコントロールを行ったが、これらの条件下ではリン酸もH2も検出されなかった。 In vivoの結果は、示されたP源を2.5μmol含む0.4％グルコース／モプスブロス中のWM3924（Δlac X74，Δphn 33-30，ΔhypABCDE） の成長中に生成したH2量を示す。 このレベルのP（500μM）は成長限界であるため、培養物が飽和状態に達したとき、P源は完全に同化されると予想される。 密閉したバイアル内で37℃で一晩培養した後、ヘッドスペースを熱伝導度検出器付きガスクロマトグラフィーでH2を測定した。 in vitroとin vivoの両実験は好気的に行われた（すなわち、白金酸化中にO2が存在した）。
in vivoでのH2測定は、大腸菌がH2の生成と消費の両方を行うことができる複数の水素化酵素を持っているという事実によって複雑になっている。 この問題を回避するために、前駆体タンパク質を成熟できないために活性のあるヒドロゲナーゼを生成できないΔhypABCDE変異体を構築した(32)。 密閉されたチューブ内で好気的に成長したhyp変異体は、成長限界レベルの白金で成長した培養物でもほぼ化学量論的量のH2を生成したが、限界レベルのリン酸またはリン酸エステルホスポセリンで成長した培養物ではH2が検出されなかった（図2B）。 白金の効率的な酸化は、大腸菌アルカリホスファターゼに特有の特徴のようである。 複数の高活性ホスファターゼを生産することが知られている枯草菌 (33) や、BAPとは異なるホスファターゼを生産することが知られているP. stutzeri (Pt脱水素酵素系を持たない株において) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, and W.W.M., unpublished data) も、PtのみをPソースとして用いることができるが (Fig. 3A ) 、両生物は、唯一のPソースであるホスポセリンの培地で増殖する (data not shown)。 したがって、これらの生物が産生するホスファターゼは、生育を維持するのに十分な速度でPtを酸化することができない。 また、市販の子牛腸管ホスファターゼ（CIP）とエビアルカリホスファターゼ（SAP）についても、Ptからリン酸を生成する能力を評価した（Fig.） 真核生物のホスファターゼは一晩培養すると少量のリン酸を生成したが、大腸菌のBAPだけが有意な速度で反応を触媒することができた。 真核生物酵素はBAPの40倍もの比活性を持つ、より優れたホスファターゼであるため、この発見は特に驚くべきものである(27)。 これらの酵素はすべて大腸菌のBAPとかなりの相同性（25〜35％の同一性）を持っている。さらに、Ser-102（ホスファターゼ反応中に共有結合のリン酸化酵素中間体を形成する）を含む活性部位残基のほとんどが保存されている（27）
Ptの酸化は大腸菌のアルカリホスファターゼに特有のものである。 (A）Ptを唯一のP源とする培地上での増殖によって示される、B. subtilisとP. stutzeriのPt酸化能力を、図1に記載したように、試験した。 どちらの菌もPt培地では生育しなかったが、リン酸培地では生育した。 このように、両菌とも活性なホスファターゼを持っているにもかかわらず、成長を支えるのに十分な速度でPtを酸化することができないのである。 P. stutzeri WM3617（ΔptxA-htxP、Δphn）は、この生物の2つの特徴的なPt酸化経路を排除する変異を含んでいるが、ホスファターゼ発現には影響を与えない（9, 10）。 (B）BAP（大腸菌アルカリホスファターゼ）、SAP（エビアルカリホスファターゼ；Roche Applied Science, Mannheim, Germany）およびCIP（子牛腸管ホスファターゼ；Sigma）は、上記のようにPt酸化についてアッセイされた。 各アッセイで56μgの示されたホスファターゼを使用したが、これはpNPP加水分解で測定すると、3BAP、32SAP、および65CIPホスファターゼ単位に相当する。 真核生物酵素のホスファターゼ活性がはるかに高いにもかかわらず、BAPのみが有意な速度でPt酸化を触媒した。 7983>
Ptの酸化は、リン酸エステル加水分解（図4A）と同様のメカニズムでBAPによって触媒されると考えるのが妥当であると思われる。 したがって、Ptはヒドリドアニオンを正式な脱離基とするBAPによって加水分解される可能性がある。 この考えを支持するものとして、活性部位 Ser-102 残基をアラニンに変更した phoA 変異体は、Pt を唯一の P 源として利用できないことから、このアミノ酸がリン酸エステル加水分解 (27) と Pt 酸化に必要であることがわかった (Fig. 4B ) 。 基質から水性プロトンへの直接的なヒドリド移動は生化学的に前例がないが、リン酸-白金カップルの強い還元電位（E o′ = -0.650 V）を考えると、この反応は熱力学的に合理的である。 したがって、H生成反応は非常に有利である：ΔG o′ = -46.3 kJ/mol (ref. 34の酸化還元電位から計算)。 もし、白金酸化の加水分解モデルが正しいと証明されれば、非常に珍しい酵素反応となる。 これまでの研究で、BAPはホスホジエステル(35)、ホスホアミド(36)、硫酸エステル(37)、チオリン酸(38)も加水分解することが分かっている。 しかし、これらの反応は、より優れた脱離基を伴うにもかかわらず、白金加水分解反応よりもかなり遅い速度で起こる。 また、酸化還元反応でもない。 アルキルホスホン酸の加水分解を含む類似の反応はBAPによって触媒されない。これは生化学的（39）およびΔphn株がこれらの化合物を唯一のP源として使用できないこと（13）で示されている＜7983＞＜8262＞図4．
BAPによるPtの酸化は、ヒドリドアニオンを脱離基とする加水分解によって起こる可能性がある。 (A）BAPによるリン酸エステル加水分解の化学的メカニズムは、リン酸エステル上の活性化セリン残基（Ser-102）による求核攻撃で、ホスホセリン酵素中間体が形成される。 アルコキシドの脱離基は溶液から速やかにプロトンを獲得し、対応するアルコールを形成する。 白金の酸化は、ヒドリドアニオンを脱離基とする同様の機構で起こる可能性が高いと思われる。 (B）Pt の酸化における Ser-102 の役割を、phoA 遺伝子の Ser-102-Ala 変異を持つ変異体が Pt 培地で成長できるかどうかを調べることによって検証した（Fig. 1 参照）。 この変異体は白金培地で生育できず、白金酸化に活性部位であるSer-102が必要であることが示された。 宿主株はBW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610とWM3611はそれぞれ野生型phoA遺伝子 (phoA+) またはphoA-S102A変異体 (Ser-102-Ala) をコードするプラスミドpKY1、pKY2の1コピーインテグラントを搭載している。
白金デヒドロゲナーゼ（PtxD）は、白金の酸化を触媒することが示された唯一のin vitro特性化酵素であった（11）。 BAP反応の詳細は未解明であるが、この2つの酵素の化学機構は明らかに異なるものである。 PtxDが酸化還元反応の電子受容体としてNADを必要とするのに対し、BAPが触媒する反応は外来電子受容体を必要とせず、反応の大きな熱力学的駆動力を利用して、水から高還元生成物（H2）を生成する、本質的に不可逆な反応（計算K eq = 1.1 × 108）である。 他のすべての既知のH2生成反応は、化学平衡に近い状態で進行し、通常は可逆的である。 さらに、他のすべての既知のヒドロゲナーゼは、その活性部位に鉄かニッケル、あるいはその両方を含んでいる(40)。 この観察には、メタン生成古細菌のいわゆる「金属を含まない」H2生成酵素であるメチレンテトラヒドロメタノプテリンデヒドロゲナーゼも含まれており、現在ではFeも含んでいることが知られている(41)。 一方、BAPは、加水分解活性にZnとMgの両方が必要であるが、酸化還元活性金属を含んでいない(27)。 BAPをキレート剤で処理するとPtの酸化が阻害されることから、金属がPt反応に関与していることが示唆される（データは示していない）
最後に、今回発表したin vivoデータは、Pt酸化反応が生物的に関連性があることを示唆している。 多くの細菌が白金酸化に特化した酵素を持つという観察は、この形質が微生物集団において強い選択圧力の下にあることを示している（4, 5, 9, 42）。 この事実を念頭に置くと、真核生物の酵素はリン酸化酵素としてははるかに優れているが、白金酸化はできない、ということは興味深いことである。 この観察から、大腸菌のBAPは最も効率の良いホスファターゼになるように進化したのではなく、Ptを加水分解する能力を持つホスファターゼになるように進化した可能性が出てきた。 この考えは、リン酸飢餓条件下で大腸菌BAPが非常に高発現（全細胞タンパク質の6％まで）するという不思議な観察とも一致する(28)。 この現象に対する従来の説明は、ある未知のBAP基質が加水分解に乏しく、したがって競争的な増殖速度を維持するために大量の酵素を必要とするはずだ、というものであった。 しかし、多種多様なリン酸エステル基質の加水分解速度の測定値にほとんど差がないことから（39, 43）、この貧弱な基質がリン酸エステルである可能性は低いと思われる。 一方、白金の加水分解速度はリン酸エステルの加水分解速度よりも大幅に低いことから、リン酸欠乏大腸菌で観察される極端なレベルのphoA発現を説明する基質は白金である可能性が示唆された。 このユニークな反応のさらなる研究は、酸化還元化学やリン酸基転移反応の理解だけでなく、ヒドリド移動、H2生成反応、自然界における還元型P化合物の役割に関する知識にも貢献すると思われる
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