2.19.2.3.3 溶出条件
効果的な溶出液は、固定化Absに悪影響を与えずに分析物-抗体相互作用を破壊することが理想的である。 ディスプレーサーとは、生物学的特異的な脱離を引き起こすことができる高濃度の交差反応性分子のことです。 ディスプレーサー分子は、結合した分析対象分子と競合し、大過剰のディスプレーサーにより分析対象分子の定量的な脱離が保証されます。 最適な性能を得るためには，ディスプレーサーはいくつかの基準を満たさなければならない。 (1）固定化抗体との交差反応性が高いこと，（2）大過剰になるとピークが突出して分析対象物の検出を妨害しやすくなるので，分析対象物の保持時間とは大きく異なること，（3）0.01～0.1％の微量不純物がクロマトグラムを乱すので安定性と純度が高いこと，（4）安価で無毒，実際の試料には存在せず，分析対象物と比較して検出性が低いこと，などである。 また、大量の溶出液が必要であり、従来のSPE担体では分析前に再濃縮が必要であった。
タンパク質のような大きな分子の溶出には、カオトロピックイオンがよく使われる。 これらのイオンは、大きな分子、すなわち抗体や標的分子の周囲の水の構造を破壊し、大きな分子の構造および分析対象物と抗体との間の疎水性相互作用の破断を誘発する。 最も一般的なカオトロピックイオンは塩化物イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、チオシアン酸イオンで、濃度は1.5から8 mol l-1である。 しかし、ISからのタンパク質の脱着にうまく適用できる様々な水溶液は、低分子を脱着できないことが示された。 タンパク質の脱離は、主に結合したタンパク質の構造変化（部分変性）に基づくものであり、固定化された抗体の構造変化に基づくものではないと考えられる。 したがって、変性に弱い低分子の溶出には、より厳密な条件が必要となる。 また、4℃から43℃への温度上昇に伴い、抗体-被酸化物相互作用の解離定数が2桁ほど増加する可能性がある。 この方法は、低分子の溶出に適用するには、十分な効果が得られない。 ISから低分子を脱離させるために、低pH溶液による溶出を行うことが多いが、抗体の等電点から3単位のpHが必要である。 このような溶出（イオン強度を変えずにpHを変化させる）により、不安定な抗体を傷つけずに済むのです。
ISからの小分子の効率的な溶出は、水-有機修飾剤混合物の量を減らすことで達成することができる。 例として、図6は、2つの除草剤、イソプロツロンとアトラジンの溶出プロフィールを示している。 溶出溶媒は水と混合したメタノール，エタノール，ACNで評価した。 アトラジン，イソプロツロン，2,4,6-トリクロロフェノール，ペンタクロロフェノールについて，酸性水または非酸性水に有機溶媒を増量した溶出液を用い，それぞれの分析種を添加した水試料を浸透させ，対応するISからの溶出プロファイルを測定した。 ACN: アセトニトリル; MeOH: メタノール; EtOH: エタノール; AA: 酢酸; TFA: トリフルオロ酢酸。 テストした3つの溶媒は、両方の分析物を完全に溶出させることができます。 しかし、ACNは最も高い溶出強度を示し、この溶媒の含有量が最も少ない場合、両方の分析物が完全に溶出される。 イソプロツロンとアトラジンを回収するためには，ACNの含有量が40%と60%で十分であり，メタノールは60%と80%が必要であった。 この場合，溶媒の溶出強度は溶媒の疎水性に関連していると考えられ，ACN (Hildebrand solubility parameter δ = 24.3 MPa1/2) はエタノール (δ = 26.0 MPa1/2) およびメタノール (δ = 29.7 MPa1/2) よりも極性が低いことが確認されました。 これらの結果は、除草剤とそれに対応する抗体との相互作用が主に疎水性であることを示していると思われる。 非極性溶媒の存在は、抗体-除草剤相互作用の疎水性結合成分を減少させる。 しかし、疎水性結合の安定性に影響を与え、抗体の3次構造を維持し、結果として抗原を遊離させることになる。 アトラジンやイソプロトロンの対応するISからの溶出に関連するこれらの例は、溶出画分に70-80%という多量のメタノールまたはACNを直接添加することにより、効率的な溶出が得られることを示している。 このように有機修飾剤を多量に添加することで、溶出画分の体積をできるだけ小さくすることができ、溶出液中の分析対象物の濃縮が可能になる。 結合様式の選択は、このような溶出条件に適合するように注意する必要がある。 非共有結合の使用は、吸着剤からの抗体の結合を破壊するリスクなしに、このような多量の修飾剤を適用する可能性を妨げる。 抗体の固定化にゾル-ゲルプロセスを使用することも、多量の有機溶媒を使用する可能性を制限する。 抗体などの有機修飾剤を多量に使用すると、ゾル-ゲルマトリックスから抗体が溶出することが示されている8
有機溶媒と有機酸の組み合わせが必要になる場合もある。 図6も、溶出液に酸を添加した有機ハイドロ混合液を用いた抗ペンタクロロフェノールISからの2，4，6-トリクロロフェノールとペンタクロロフェノールの溶出プロファイルを示している。 トリフルオロ酢酸（TFA）を用いてpH 3で酸性化した水/ACN（20：80，v/v）または水/ACN（30：70，v/v）を用いてトリクロロフェノールを完全に回収することが可能であることがわかった。 1%(v/v)の酢酸(AA)で酸性化した場合、30%のACNのみを含む混合液が溶出に有効であった。 一方，トリクロロフェノールよりもPAbsへの親和性が高いペンタクロロフェノールは，純粋なACNやTFAで酸性化したACNでは溶出が不可能であった。
したがって、シングルユースの市販ISを使用した推奨手順を含むほとんどのオフライン手順では、脱離は高い割合の有機溶媒で、時には低いpHで達成されることになる。 また、抗原抗体相互作用に関与する電子的相互作用と疎水的相互作用の比率から、分析対象物の性質にも依存する。 最後に、非共有結合により大量の有機溶媒を使用することができないため、抗体を固定化する方法にも依存する
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