要旨
背景 アミロイドーシスは自己由来の好酸性ヒアルロン酸物質の細胞外沈殿で、特殊な染色性と線維性の超微細構造を持つ。 黄斑部アミロイドーシスは皮膚に限局しており，その病態にはいくつかの要因が提唱されている。 本症例ではEpstein-Barrウイルス（EBV）のDNAが検出されたことから，このウイルスが本疾患の病態に関与している可能性が示唆された。 目的 黄斑アメーバ症と診断された皮膚30検体およびメラノサイト性母斑を切除した縁の健常皮膚31検体について，PCR法を用いてEBV DNAの検出を行った。 結果は以下の通り。 PCRでβ-グロビン遺伝子が陽性であった患者において、EBVウイルスのBLLF1遺伝子が23名（症例8名、対照群15名）で陽性であった。 黄斑アミロイドーシス群（3.8%）と対照群（23.8%）の間でEBV DNAの存在に有意差はなかった（）。 結論 本研究の結果、EBVは黄斑アミロイドーシスの病態に関与していないことが示された。
1. はじめに
アミロイドーシスは、繊維状のタンパク質群が細胞外に沈着した状態である。 アミロイドーシスの分類には様々なアプローチがありますが、最も単純な方法は、全身型と臓器特異的（局所型）なものに分ける方法です。 皮膚はいずれの型にも含まれる組織です。 皮膚限局性アミロイドーシスは2つのタイプに分けられます。 (i)角化型（原発性と続発性がある）、(ii)結節型。 二次型は、皮膚腫瘍、炎症性皮膚疾患、光線療法など他の皮膚病変に続発するものである。 角化性アミロイドーシスには、斑状アミロイドーシスと苔癬状アミロイドーシスの2種類が確認されており、後者の方が多くみられます。 角化性アミロイドーシスでは、基底部のケラチノサイトに由来するケラチン沈着が主にCK5陽性である。 角化型は東南アジア、南米、中国に多くみられる。 家族性（10%）と散発性があり、後者は女性に多い。 黄斑アミロイドーシス病変は通常、灰褐色の斑点からなる不定形の縁を持つ色素沈着斑の形で現れ、しばしば網状または波状の外観を呈します（図1）。 痒みはアミロイドーシス発症前の一般的な症状です。
この疾患の病因は、沈着したケラチンがケラチノサイトに由来することを除いては、完全には解明されていない。 発症機序としては、アポトーシス（フィブリル）説と分泌説の2つが提唱されている。 アポトーシス説では、基底層で傷ついたケラチノサイトが変性し、そのコロイド体が真皮組織球や線維芽細胞によって真皮乳頭部でアミロイドに変換されるとする（図2）。 分泌説によれば、変性した基底ケラチノサイトに由来するアミロイドの沈着が、損傷した角質層を介して真皮乳頭部に広がる。 黄斑アミロイドーシスの発症には、人種的要因、遺伝的素因、環境要因、性（女性）、女性ホルモン、日光への暴露、摩擦（長期の擦過）、アトピー、自己免疫（全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、全身性硬化症、サルコイドーシス、IgA腎症との関連から）、EBVへの感染などが関与するとされている ……。 EBVは黄斑アミロイドーシスの表皮に存在することが報告されており、ケラチノサイトの変性に寄与する因子として作用していると思われる。
原発性皮膚アミロイドーシスの病因におけるEBVの役割は、1つの症例報告と中国からの27人の患者を含む2つの先行研究のみによって評価されています。 EBVと黄斑アミロイドーシスとの関連についての研究が不足していることを考慮し、我々はイランでこの点についての研究を行うことにした。 EBVと関連する場合、将来的に抗ウイルス剤がこの疾患の治療に使用できるかもしれない。 材料と方法
この症例対照研究では、年齢と性をマッチさせた黄斑アミロイド症の患者38人と黄斑アミロイド症ではない患者の切除メラノサイト母斑周辺の健康な皮膚試料38人が、非ランダム客観志向サンプリングに基づいて臨床検査で登録された。 対象は、マシュハドにあるイマーム・レザ病院の病理部に保管されている、病理報告および臨床症状から黄斑アミロイドーシスと診断された十分な組織を含むパラフィンブロックであった。 除外基準は、記録のデータが不完全なブロックとPCRのための不十分なサンプルであった。
症例群では、アミロイド沈着が光学顕微鏡とコンゴレッド染色で確認された。 次のステップでは、症例群と対照群のブロックからそれぞれ6枚の5μm切片を滅菌刃を用いて無菌状態で作製し、滅菌エッペンドルフチューブに収めた。 パラフィン除去
Xylol/ethanol を用いてパラフィン化した組織を脱パラフィン化した。 組織切片を入れたマイクロチューブに1mLのキシロールを加え、室温で30分、一定に振盪しながらインキュベートした。 次のステップでは、マイクロチューブを13,000 rpmで10分間遠心分離し、その上清を廃棄した。 この2つのステップを1回ずつ繰り返した。 沈殿物に500μLの100％エタノールを加え、マイクロチューブを数回反転させた後、13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。 このステップを再度繰り返した。 最後に、得られた沈殿物を室温に置き、エタノールを完全に蒸発させたが、沈殿物は除去しなかった。 DNA抽出
DNA抽出は、BIO BASIC INC（カナダ）のキット（ロット番号8401-140116）を使用した。 抽出にはLysis buffer-Tを使用した。 次に、各マイクロチューブに100μLの抽出バッファーと10μLのプロテイナーゼKを加え、混合した。 この混合液に組織試料を加え、室温で10分間インキュベートした。 その後、95℃で3分間インキュベートし、プロテイナーゼKを失活させた。100 μL Universal Buffer NSTをチューブに加え、10回倒立させた。 得られた混合液をPCRに使用した
2.3. PCR
本研究では、黄斑アミロイドーシスにおけるEBVゲノムの存在を検出するためにPCRを使用した。 パラフィン包埋ブロックから抽出したDNAをβ-グロビン遺伝子プライマーを用いて品質判定を行った後，PCRを行った． 本研究で使用したGH20とPC04のβ-グロビン遺伝子プライマーは260bpの断片を増幅した。 これらのプライマーの配列は以下の通りであった。 GH20: 5′ GAA AGG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′。目的のプライマーを用いて260bpの断片を生成したサンプルは、EBVウイルスBLLF1遺伝子の増幅に好ましいと考えられる。
抽出したDNAサンプル中のEBV配列の存在は、ロット番号935701（Sina Clon, Iran）のシナジェンキットを用いて検査した。 このキットは、感染したサンプル中のEBV DNAの品質をPCRで判定するために設計されたものである。 混合には、recombinant Taq DNA polymerase、PCR buffer、MgCl2、dNTPs、プライマーの混合物として最適化された1x PCRが使用された。 gp 350/220をコードするBLLF1遺伝子の特異性の高い繰り返し領域がプライマーにより増幅される。 これらは少なくとも30コピーのEBVを検出することができる。 239bpまたは256bpの断片の存在は、陽性試験結果を示す。
データ分析は、SPSS 11.5 ソフトウェアを使用して実行されました。 グラフと統計表はデータの記述に使用され、カイ二乗と独立検定は健常者と患者のサンプルのEBVを比較するために使用された。 すべての検定において、有意水準0.05を考慮した。 結果
患者の50％は男性（19/38）、50％は女性（19/38）であった。 年齢層は20歳未満3名（7.9％），20～30歳5名（13.2％），30～40歳10名（26.3％），40～50歳13名（34.2％），50～60歳4名（10.5％），60歳以上3名（7.9％）であった。 最小年齢と最大年齢はそれぞれ19歳と76歳であった。 感染部位は，体幹が27例（71.1％），四肢が11例（28.9％）であった。 試験群と対照群は年齢（），性別（）を一致させた。
76検体（症例38，対照38）についてβ-グロビン遺伝子のPCRを行い，61検体（症例群30，対照群31）で陽性，15検体（症例群8，対照群7）で陰性であった（図3）。
PCRでβグロビン遺伝子が陽性となった61検体において、EBV由来のBLLF1遺伝子は23例（試験群8例、対照群15例）で陽性、38例（試験群22例、対照群16例）で陰性であった（図4）。
EBVからのBLLF1遺伝子のPCRは試験群で26.7%、対照群で48.4%の陽性であった。 カイ二乗検定の結果、EBVと黄斑アミロイドーシス（）には相関がなかった（表1）。
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4.考察
アミロイドーシスは自己由来の好酸性ヒアルロン酸物質の細胞外沈着として知られており、特異な染色と超微細構造の特徴を有している。 この疾患は、全身疾患を背景に発症する場合と、皮膚に限局して発症する場合がある。 黄斑アミロイドーシスは、皮膚に限局している。 EBVは、ケラチノサイトによるアミロイド物質の分泌を刺激するか、あるいはケラチノサイトの変性と変性したケラチノサイトフィラメントのアミロイドへの変換の刺激となる可能性がある 。 最近の研究では、EBVの継続的な繁殖に上皮細胞が関与していることが指摘されている。 低分化扁平上皮に見られるEBV細胞表面レセプターは、表皮ケラチノサイトへの直接感染を示唆している。 感染は生殖層で起こるかもしれない。しかし、ウイルスの複製は細胞の成熟と分化を通してのみ可能である。 ヒトのケラチノサイトケラチンの発現は、EBV感染後in vitroで変化し、線維芽細胞への転換をもたらす。 線維芽細胞はケラチン凝集体を貪食し、アミロイドに変換することができる。
Drago らは、1996 年にイタリアでこの相関を示した。 患者は30歳の女性で、慢性疲労症候群の症状とともに、胸部と背部にかゆみを伴う褐色の丘疹と斑点が10年以上続いていた。 彼らはin situ hybridization法を用いて表皮病変部にEBVゲノムを確認した。 EBVゲノムは主に表皮基底細胞および高層細胞で、特に細胞質で示された。 血清検査でもEBVは陽性であった。 アシクロビルとインターフェロンαによる抗ウイルス療法により，皮膚病変と全身症状が改善された． もう一つの研究は，1997年に台湾で，苔癬および黄斑アミロイドーシスと診断された患者27人の皮膚組織について，Changらによって行われた． In situ hybridization法により11名（40.7%）の病変部にEBV DNAが検出されたが、対照群（二次性皮膚アミロイドーシス3名、原発性全身アミロイドーシス2名、慢性単純苔癬4名）ではEBV DNAが検出されなかった。 本研究では、黄斑アミロイドーシス患者8名と対照者15名にEBV DNAが存在した。 (1)黄斑アミロイドーシスとEBV感染との関連性の欠如：EBVと黄斑アミロイドーシスとの決定的な相関を示す十分な証拠を提示した研究は少なく、本研究の結果に基づいて、この結論を下すことができる。 (2)方法論（PCRとin situ hybridization）：我々はEBV DNA検出において、陽性および陰性対照のある感度の高い方法を用いている。 これまでの研究から、PCRはin situ Hybridizationと同程度の感度を持つ。 しかし、我々はin situ hybridizationを使用しなかったので、ケラチノサイトではなく皮膚の循環B細胞である可能性のあるEBVに感染した細胞を正確に特定することができなかった。 (3)対照群：我々の研究ではメラノサイト母斑周辺の健康な皮膚を対照としたが、Changの研究では他の皮膚疾患を対照とした。 (4)皮膚アミロイドーシスのタイプ：我々の研究では、すべての患者が黄斑アミロイドーシスだったが、以前の研究ではほとんどの患者がアミロイドーシス苔癬であった。 結論
本研究の結果によると、EBVと黄斑部アミロイドーシスには相関はなかった。 黄斑部アミロイドーシスにおけるEBV DNAの比較研究において、より正確な結果を得るためには、新鮮な組織または急速凍結生検パンチの使用と同時に、患者の抗EBV抗体の血清学的研究を行うことを推奨する。 In situ PCRは、サンプル中のEBV DNA陽性細胞を特定するために使用することもできます。 また、本研究で使用したBLLF1遺伝子が変異しているEBVサンプルもあるため、他の遺伝子を用いて組織内のEBVを検出することも可能です。
利益相反
著者らは利益相反を宣言しない。
謝辞
著者らは、Narges Nazeriの論文に関する研究提案（No. 911283）の財政支援と承認についてMUMSリサーチデピュティに深い感謝を表明している。 また、マシュハド医科大学の研究副代表による財政的支援に謝意を表する。