Pharmaceutical removal under oxic versus anoxic conditions

In the absence of MnO2, は、すべての実験において、酸化・無酸素の両条件下で24時間以内に7種類の医薬品が除去されないことが確認された（Table S3）。 MnO2存在下では、メトプロロール、プロプラノロール、ジクロフェナクはデミウォーター（図1a、b）およびリン酸バッファ（図1c）の両方で24時間以内に除去されるが、他の4つの医薬品については除去が観察されない（図S3）。 さらに、ジクロフェナックの除去効率は無酸素条件下で高く、メトプロロールとプロプラノロールは酸化条件下で高い除去率が観察されることが示された。 脱塩水中の混合医薬品溶液を24時間培養した結果、無酸素状態で78%、酸化状態で59%のジクロフェナク除去率が確認されました（Fig. 1a）。 しかし、メトプロロールは、酸化条件下で69%除去されたのに対し、無酸素条件下では33%しか除去されなかった。 同様に、プロプラノロールは、酸化条件下では84%であったのに対し、無酸素条件下では51%が除去されました (Fig. 1a) 。 ジクロフェナックと他の6種類の医薬品を混合した場合（Fig. 1a）の除去効率は、ジクロフェナックのみが存在する脱塩水系（Fig. 1b）のそれよりも低いことが分かりました。 無酸素状態ではMnO2により92%のジクロフェナクが除去され、酸化状態では69%のジクロフェナク除去が確認された（Fig.1b）。 1

MnO2による医薬品除去に対するpHおよびイオン強度の影響を排除するために（Gaoら、2012；Huguetら、2013）、50 mMリン酸緩衝液でpH（〜7）を制御し、イオン強度は（NaClで0.1 M）を維持しています。 リン酸塩緩衝液を用いたさらなる実験では、無酸素条件下ではジクロフェナクの90%が除去され、酸化条件下ではほぼ完全に除去されることが確認された（Fig.1c）。 ジクロフェナックの除去効率は、無酸素状態でも酸化状態でも同程度であることがわかる。 これまでの研究では、無酸素条件下での医薬品を含む有機物の除去効率は、酸化条件下と同等か低いことが分かっている (Barrett and McBride 2005; Gao et al. 2012; Zhang and Huang 2005a) 。 しかし、我々は、無酸素条件下でのジクロフェナックの除去効率が、酸化条件下よりも高くなる可能性があることを顕著に観察している。 このユニークな結果は、MnO2を用いた無酸素条件下での医薬品除去のメカニズムに関するさらなる研究の方向性を示している。

酸化条件下での以前の研究 (Jiang et al. 2010a; Zhang et al. 2008; Zhang and Huang 2005a) で行ったように、初期培養期間を持つ擬一次モデルを使って除去動態を分析した（表 1）。 異なる医薬品の初期除去率 (robs, init) と初期除去速度定数 (kobs, init) を比較すると、酸素がMnO2による医薬品除去に影響を与えることがわかります。 医薬品混合物およびジクロフェナクのみを含むデミウォーターでは、ジクロフェナクの除去は無酸素条件下で促進され、メトプロロールとプロプラノロールの除去率は無酸素条件下で低くなった。 さらに、ジクロフェナクはMnO2を含む酸化リン酸緩衝液に単独で溶解した場合に最も高い除去率を示した。

Impluence of pH and MnO2 morphologies on diclofenac removal

pH はMnO2による医薬品除去に影響する重要なパラメータである。 以前の研究では、MnO2 の形態も医薬品除去に影響を与えることが示されています (Shin and Cheney 2004)。 しかし、無酸素状態でのMnO2によるジクロフェナク除去の新しい観察結果は、無酸素状態でのMnO2による医薬品の除去メカニズムが、酸化状態での除去メカニズムとは異なる可能性があることを示しています。 したがって、ジクロフェナク除去におけるpHとMnO2形態の影響を調べることは、除去機構を理解する上で重要である。 そこで、50 mMリン酸塩緩衝液で設定したpH ～ 4.5, pH ～ 7.0, pH ～ 8.5の無酸素条件下で、非晶質MnO2と結晶質MnO2を用いてpHとMnO2形状の影響を調査した。 48時間以内の無酸素条件下でのジクロフェナック除去率は、pH ~ 4.5 および pH ~ 7.0 付近では100%、pH ~ 8.5 では非晶質 MnO2 で70%と変化した。 一方、結晶性MnO2では、ジクロフェナックの除去率が著しく低下した。 pH〜4.5では、結晶MnO2によるジクロフェナックの除去率はわずか21%であった。

考察

一般に、MnO2による有機物の除去は、吸着と酸化を含む2段階のプロセスである（Remucal and Ginder-Vogel 2014）。 この2段階の寄与は化合物によって様々である(He et al. 2012; Xu et al. 2008; Zhang and Huang 2005b)。 酸化的条件下では、酸素によって医薬品の除去が促進される可能性がある（Gao et al.） しかし、このことは、除去プロセスに参加する酸素が存在しない場合、デミウォーター中のジクロフェナク除去に無酸素状態が適している理由を説明できない（Fig. S4）。 MnO2によるジクロフェナク除去では、酸化的条件下と無酸素条件下で異なる中間体が形成される（図S4, S5）。 これらの中間体は、MnO2表面の反応部位に対する吸着親和性が異なり、これが酸化的条件と無酸化的条件の違いを説明する鍵になる可能性がある。 この結果から、医薬品の除去効率には2つの要因が影響すると考えられ、以下に詳しく説明する。 (1) 医薬品の分子構造と化学的性質、(2) MnO2の性質。

医薬品の分子構造と化学的性質

MnO2による有機化合物の除去には、医薬品の分子構造と化学的性質が重要である。 これまでの研究では、酸素存在下でのMnO2による酸化は、有機化合物のC-N結合の開裂を伴うことが分かっている。 メトプロロールやプロプラノロールは、N原子がアルキル基と結合したC-N結合を持っています。 これらの化合物は、酸化的条件下で除去が促進される先行研究（Table S1, S2）でテストされた化合物と類似している。 このC-N結合の開裂は、酸素の存在下でラジカルの形成につながる可能性がある（Barrett and McBride 2005; Gao et al.2012）。 ジクロフェナクの酸化は、C-N開裂の代わりに水酸化と脱炭酸を伴い（Huguet et al.2013）、メトプロロールやプロプラノロールとは異なるメカニズムである。 このことから、除去機構は医薬品の分子構造や化学的性質と密接に関係していることがわかります。

医薬品の性質はpHにも影響されます。 ジクロフェナクのpKaは低いため（pKa = 4.15）、pHレベルが低いと、負の電荷を持つ化合物が少なくなります。 このため、ジクロフェナックと、同じく負に帯電しているMnO2との間の静電的反発が小さくなる（Murray 1974）。 pHが低いほどジクロフェナックはMnO2表面に親和的に吸着し、したがってMnO2による除去の第一段階がより有利になると推測される。

MnO2 properties

MnO2の特性もpHに影響される。 pHが酸性の場合、MnO2はその等電点により負電荷も少なくなり、静電反発が少なくなり、有機化合物の吸着がよくなります。 さらに、MnO2の酸化還元電位は、pH8.0の0.76 VからpH4.0の0.99 Vまで上昇する（Lin et al.2009）。 このように、分解反応はpHが低いほどエネルギー的に有利である。 どちらの要因も、我々の研究で示されたように、より速い分解につながると考えられる（表2）。 本実験では、過去の研究で医薬品の酸化に不利とされた中性pHを使用しています（Chen et al.） また、MnO2の酸化還元電位が低いpHでは、Mn(IV)からMn(II)への電子移動に不可欠なプロトンが少なくなる。 その結果、本研究ではカフェイン、カルバマゼピン、イブプロフェン、ナプロキセンは除去されず（図S3）、メトプロロールとプロプラノールは酸化・無酸素の両条件で除去効率が低かった。

ジクロフェナク除去に影響を与えるMnO2形態の特性はさまざまであった。 我々の研究では、ジクロフェナク除去は結晶性MnO2よりも非晶質MnO2で良好であり、これは以前に報告された知見（Remucal and Ginder-Vogel 2014; Shin and Cheney 2004; Ukrainczyk and Mcbride 1992）と一致する。 アモルファスMnO2粒子は、通常、結晶性粒子よりも小さい。 したがって、アモルファスMnO2粒子は表面積が大きく、医薬品の除去率が向上する。 残念ながら、分析限界のため、アモルファスMnO2のサイズ分析は技術的に不可能と思われた（図S6）。 さらに、非晶質MnO2は少量のMn（III）を含み、MnO2の反応性と酸化能力を高めることができ（Remucal and Ginder-Vogel 2014）、したがって医薬品除去をさらに促進する。

リン酸の存在下で、MnO2によるジクロフェナク除去は無酸素状態よりも酸化状態でわずかに促進される。 Mn(II)をMn(III)に酸化するために酸素を使用することは熱力学的に好ましい反応である。 リン酸緩衝液の存在下では、リン酸はジクロフェナックの酸化からMn(II)と共にMn3(PO4)2を形成できる（式1）（Jin et al.2014）.

計算では、Mn3（PO4）2の化学構造はMn（III）を安定させ、それによって酸化条件下のMn（II）→Mn（III）酸化を促進できることを示しています(Jin et al.）。 2014). Mn2+の分析では、デミウォーターよりもリン酸緩衝液の方が高いMn(II)濃度を示しており、これは酸化的条件下でより多くのMn(III)が生成された結果であると説明している。 図1に示すように、無酸素状態よりも高いMn(III)濃度が、ジクロフェナクがより多く除去される理由であると考えられ、図2にはそのメカニズムが示されている。

MnO2 表面の反応部位

多くの有機化合物の除去には、反応性金属酸化物表面への有機分子の吸着が鍵となり、特に MnO2 表面の反応部位が重要なパラメータであることがわかっています (He et al. 2012; Xu et al. 2008; Zhang and Huang 2005b). デミウォーター中の医薬品混合溶液の結果は、ジクロフェナクと他の異なる医薬品との間で反応性部位をめぐる競争があることを示唆している。 これは、他の医薬品の存在下でジクロフェナックの除去率が低いことから明らかである（図1a、b）。

FTIRの結果に基づいて、酸化的および無酸素的条件の両方でMnO2によるジクロフェナック除去中に反応部位が明らかに消失することはなかった（図S5）が、おそらく実験中のMnO2濃度が比較的高いことに起因している。 しかし、特に無酸素条件下では、ジクロフェナクと反応させる前後のMnO2でFTIRスペクトルが異なることが明らかである。 このことは、ジクロフェナックからの中間体がMnO2の構造を変化させていることを示している。

リン酸塩緩衝液では、リン酸塩はMnO2表面に吸着し、MnO2の反応サイトをDFCと競合することにより、ジクロフェナックの除去率を低下させることができる(Yao and Millero 1996)。 その結果、リン酸塩緩衝液ではpHが低いほどジクロフェナク除去が促進されるはずであるが（緩衝液ではpH 7、デミウォーターではpH 8~9）、デミウォーターではMnO2反応部位がリン酸によってブロックされないためジクロフェナク除去が良好となった（Table 1）。 しかし、無酸素条件下では、デミウォーターとリン酸塩バッファーで同様の除去効率と速度論が観察された(Fig. 1)。 このことは、リン酸塩緩衝液中でジクロフェナクの除去を促進するメカニズムが存在し、リン酸塩がMnO2表面の反応サイトを吸着・占有することによる阻害と競合していることを示しています。 これまでの研究から、Mn(II)がMnO2表面の反応性部位を占有して、医薬品の除去を阻害することが知られている(He et al. 2012; Xu et al. 2008)。 リン酸塩緩衝液での除去結果から、酸化条件下では1.54μMのMn2+が生成し、無酸素条件下では2.16μMが生成することがわかった。 酸化条件下ではMn(II)の生成が少なく、式（1）によるMn3(PO4)2の生成が少なく、ジクロフェナク除去に利用できる反応部位が多くなったと推定される。 無酸素状態では，リン酸の吸着によるこれらの促進作用と抑制作用のバランスにより，デミ水とリン酸バッファーのジクロフェナク除去量は同程度となった

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