はじめに

1940年代にヘパリンが臨床に導入され、外科医はこの抗凝固剤を用いて閉塞性血栓の予防や治療のために複雑な手術を行うことができるようになった。 ヘパリンの有用性、全般的な安全性、性能は、血液透析、開心術、臓器移植などの手術に道を開くものでした。 今日、ヘパリンは、拡大する病状や外科手術、介入手術の予防および治療に使用されています。 しかし、ヘパリンの導入から数十年後、逆説的なヘパリンの副作用が認識されました。 ごく一部の患者では、ヘパリン治療の数日後に、原因不明の血小板数の減少がみられたのです。 通常、抗凝固療法中に血小板数が低下すると、出血性合併症の危険性があります。 しかし、この「ヘパリン起因性血小板減少症」（HIT）の患者は、静脈および動脈血栓症のリスクを抱えていました。 HIT血栓症（HITT）は、ヘパリンを中止する必要がありますが、これはこの異常な血液凝固状態を解決するのではなく、むしろ悪化させることになります。 有効な代替療法がない場合、HITTは深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中などの血栓塞栓性合併症に進展する可能性がある。 患者集団にもよりますが、ヘパリンを5日以上投与された患者の0.5〜5%にHITが発生します。 HIT患者のうち30-72%が血栓性合併症を発症し、10%が四肢切断のリスク、20-30%が死亡のリスクである 。 HIT(T)症候群の管理の難しさとその悲惨な結末から、HIT(T)の発症リスクを最小限に抑え、安全で有効な代替抗凝固薬の発見を目標に、HIT発症メカニズムに関する多くの研究が行われている。

初期の研究者は、HITの原因物質として、血小板消費と凝固亢進状態を引き起こす、血小板活性化抗体を特定した。 ヘパリン曝露から症状発現まで5〜15日の間隔があることから、HITに免疫の関与があるとの最初の疑いは、HIT患者の血清またはそのIgG画分がin vitroでヘパリン存在下のドナーの血小板を活性化することを証明することで確認されました …。 しかし、「ヘパリン抗体」の単離には至らなかった。 10年後、研究者はHIT抗原がヘパリンそのものではなく、ヘパリンと内因性血小板タンパク質である血小板因子4（PF4）との特異的複合体であることを発見した。 PF4/heparin 抗体の力価、アイソタイプ、アビディティ、ヘパリン類似薬の特性、投与期間、投与量など、HIT の病態に最も密接に関連する項目を評価するために多くの研究がなされてきました。 HIT抗体の免疫原性（発生）と病態（機能）のリスクにおけるPF4の役割について扱った報告ははるかに少ない。 本総説では、PF4抗原の利用可能性がHITに果たす中心的な役割を強調する。

Platelet Factor 4

Platelet Factor 4 (PF4) はケモカインCXCL4としても知られ、生理的pHとイオン強度において4量体を形成する陽イオン性の7.8kDaタンパク質である … 続きを読む PF4は活性化された血小板のα顆粒からコンドロイチン硫酸プロテオグリアン担体との複合体として放出される。 血漿中では、内皮細胞上の親和性の高いヘパラン硫酸に移行して速やかに消失し、局所のアンチトロンビン（AT）活性を阻害して、凝固を促進する。 止血における役割に加えて、PF4は他の多くの生物学的効果を持っており、それは細胞外のグリコサミノグリカン（GAGs）との関連に依存していると思われます；これらは他のレビューにあります。 血漿中のPF4濃度は、血小板の活性化の程度や期間、PF4のターンオーバーに比例し、各患者の基礎的な臨床状態に大きく依存する。 PF4の増加は、炎症性疾患や感染症、糖尿病、心血管疾患、腎疾患、アテローム性動脈硬化症、その他血管の健康に影響を及ぼす状態、あるいは外傷性医療処置や心肺バイパスに反応した場合に観察されます …… PF4の増加は、炎症性疾患や感染症、糖尿病、動脈硬化症、その他血管の健康に影響を及ぼす状態、あるいは外傷性医療処置や心肺バイパスに反応した場合に観察されます。 活性化された血小板から放出されたPF4は、内皮細胞上のヘパラン硫酸と急速に結合し、より高い親和性を持つヘパリンによって再び循環に戻されることができる。 このヘパリン放出可能なPF4プール（HR-PF4）は、ヘパリン注射の前後に血漿PF4を測定することで評価できる。その後のヘパリン投与では、内皮にPF4が蓄積する速度に関連した間隔で、PF4がより少なく放出される。 HR-PF4は、PF4の利用可能性を示すもう一つの指標である。 健康な対照群と比較して、細胞外PF4のレベルと再確立の速度は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、腎臓、心臓血管、冠動脈疾患を含むいくつかの患者集団で高いことが証明されている。

PF4の利用可能性は、急性および慢性の血小板活性化の両方に影響され、論理的には抗凝固療法におけるPF4/ヘパリン抗体の生成のリスクに関与しています。 このことは、特定の患者集団がHIT抗体を産生するリスクが高いことが知られているという一般的な観察に対する説明を示唆している。

HIT 病態における PF4 の役割（抗体機能）

HIT 抗体の存在は、血清陽性の患者の大部分において血小板減少や血栓症を引き起こさないことは、文献によく示されています …。 しかし、ある種のHIT抗体がPF4抗原と結合して免疫複合体を形成すると、その後にFcガンマ受容体を介した血小板活性化が起こり、血小板減少症や血栓症につながることがあります。 したがって、HIT症候群は、十分な力価および特異性を有するHIT抗体の存在だけでなく、抗原性のPF4標的の存在にも依存する。 血小板の活性化とPF4の放出を引き起こすことによって抗体形成のリスクを高める条件（上記の通り）の多くは、同様にHIT抗体免疫複合体を介した血小板活性化による臨床結果のリスクを高める。

ヘパリンの存在に依存する免疫形成（抗体の形成）とは対照的に、HITの病因（抗体の機能）は「遅延HIT」と呼ばれる抗凝固療法を停止した後に起こり得る。 PF4 が内皮細胞、単球、血小板の表面のグリコサミノグリカンに結合し、HIT 抗体の標的抗原を提示することが研究により証明されています . このように、活性化血小板からのPF4が血管細胞上のGAGと結合すると、ヘパリン非存在下でもHITの抗原性標的が利用できる可能性がある。 細胞外GAGに結合したPF4が抗体形成を開始するという証拠はないが、ヘパリン曝露によるHIT抗体はこれらの部位に結合し、HIT抗原-抗体免疫複合体を形成する可能性がある。 実際、HITに関連した血栓性合併症は、カテーテル挿入による血管損傷部位や手術部位など、PF4が高濃度に蓄積しやすい部位でしばしば発生する 。 入院中や入院後の様々な状況により、血小板の活性化が起こり、GAGと結合したPF4が増加し、HITの標的抗原となる可能性がある。 動脈硬化、糖尿病、高コレステロール血症などの慢性疾患や、感染症や外傷の自然発症・隔離例は、血小板の活性化やPF4標的抗原の利用を増加させることにより、血清陽性患者のHIT発症の可能性を変化させる可能性がある。 現在、臨床症状の評価に基づくスコアリングシステムと、PF4/ヘパリン抗体の力価、アイソタイプ、in vitro 機能の実験室測定が、臨床的 HIT の可能性を評価する基礎となっています ……このようなスコアリングシステムにより、HIT の可能性が評価されます。 血小板の活性化の状態やPF4のターンオーバーを含む患者関連因子が、HITのリスクに関与していることは確かである。

PF4/Heparin complexes

HIT 抗体の発現と機能性は PF4 の有無だけでなく、PF4 とヘパリン（または他の GAG）の量に依存している。 カチオン性のPF4四量体とヘパリンや他の高分子アニオンとの結合は、比較的非特異的な静電相互作用によって起こり、得られる複合体のサイズと特性は、それぞれの濃度によって支配される。 HIT患者から分離された抗体を用いて、最も抗原性の高いPF4/ヘパリン複合体の特性を明らかにするために、多くのin vitro試験が実施されてきました（交差反応）。 これらの研究から、PF4とヘパリンがほぼ等モル比で形成される複合体は、最適な抗体結合と相関することが示されています。 ヘパリンの比率が高い場合、複合体は小さくなり、血小板活性化HIT抗体免疫複合体を形成しない。 血小板因子4とヘパリンの比率（PHR）が3：1から0.7：1の範囲では、表面電荷が中性で、密接に近似したPF4四量体のアレイを持つ超大型複合体（ULCs）が形成されます。

実験および臨床研究では、抗原性と免疫原性、すなわち抗体結合または交差反応と、抗体形成または血清転換の間に区別があることが分かっています。 マウスを用いた実験では、マウスPF4（mPF4）／ヘパリン複合体が、mPF4単独ではなく、mPF4／ヘパリン反応性抗体の形成を引き起こすことが実証されました。 mPF4/ヘパリン複合体の濃度が高いほど、抗体形成は顕著であった。 ある驚くべき研究では、等モルで電荷が中性のmPF4/ヘパリン比が最大で最も抗原性の高い複合体を形成する一方で、表面電荷が正で小さい高PHR複合体（すなわち、PF4>>ヘパリン）は、mPF4/ヘパリン抗体の形成をより大きくすることが示されました。 様々な臨床試験で、低分子ヘパリン（LMWH）は未分画ヘパリンと比較してHIT血清転換のリスクがはるかに低いと結論付けられていますが、in vitroの試験でLMWHはHIT-抗体と交差して最大限の血小板活性化を引き起こすとされています … 五糖のフォンダパリヌクスで治療された患者でHIT抗体のセロコンバージョンが報告されている。 驚くべきことに、フォンダパリヌクスによって誘導された抗体は、in vitroでヘパリンおよびLMHWと交差反応を示すが、フォンダパリヌクスとは交差反応を示さない。 6995>

PF4 とヘパリンの抗凝固比が、抗原性あるいは免疫原性複合体の抗凝固比と異なることも興味深い点である。 PF4より過剰なヘパリンのみが抗凝固作用を有する。 ヘパリンは、PHR中にin vitroで存在するPF4によって0.42:1（すなわちPF4<ヘパリン）という低さまで中和されます。 ヘパリンは、HIT抗体との結合が最大となる等モル範囲のPF4/ヘパリン複合体によって中和されると考えられる。 有効な抗凝固療法中に存在するであろうPF4/ヘパリン比に免疫の過程を帰結させることは困難である。 逆に、PHRが高いほど免疫原性が高いという可能性は、ヘパリンフラッシュのような最小限のヘパリン曝露や、予防的ヘパリンと治療的ヘパリンのような低い相対投与量が、しばしば高い免疫原性を示す理由を説明するものである。

PF4 と自然免疫

PF4/ヘパリン複合体がHIT抗原であるという発見により、ヘパリン結合PF4構造の「異質性」が免疫反応と抗体の生成を誘発するように思われた。 しかし、HIT患者から分離した抗体を用いた研究により、他のグリコサミノグリカン製剤と結合したPF4もPF4/ヘパリン抗体の標的となり得ることがすぐに明らかになった。 これらの抗体は、内皮細胞、単球、血小板上のPF4や、アニオン性表面に固定化されたPF4にも結合する。 コンフォメーション・ネオエピトープは他のPF4結合パートナーによって露出されうるが、未分画ヘパリンほど免疫原性の高いものはない。 6995>

HITの免疫反応はいくつかのユニークな側面を持っており、まだ完全には解明されていない。 適応的な免疫反応は、IgGアイソタイプの抗原特異的な抗体と、その後の抗原曝露に効率よく反応するための免疫記憶によって特徴づけられる。 後天性免疫応答は、抗体を産生するB細胞が、標的の特異的に提示されたエピトープを認識するT細胞と協働するため、比較的ゆっくりと起こる。 一般的な病原体のクラスに対しては、より即時的で特異性の低いB細胞応答が起こり、過去の曝露とは無関係である。 この迅速な自然免疫反応は、特異性が低く、一過性のIgM抗体群によって特徴づけられる。 HITの免疫応答はユニークである。 それは、ヘパリン曝露後わずか数日で生じるPF4/GAG特異的な抗体によって特徴づけられる。 このように急速に出現するにもかかわらず、HIT 抗体のアイソタイプは IgG であることが多い。 しかし、HITの抗体価は急速に低下し、メモリーB細胞応答は認められません。 HITの免疫原性は、自然免疫反応と適応免疫反応のいずれにも典型的なものではなく、それぞれの特徴を有している

止血における役割に加えて、血小板は免疫エフェクター細胞としてますます認識されている . PF4 は、高度に保存された宿主防御エフェクターポリペプチドであるキノシジンのメンバーであり、抗菌活性と白血球走化活性を示し、自然免疫系と適応免疫系の両方の作用に関与しています。 PF4や他のキノシジンは、カチオン性の両親媒性モチーフを持ち、荷電した脂質膜と相互作用して破壊する。 その抗菌的な役割として、PF4は特定の種の細菌、真菌、寄生虫に結合し、免疫防御反応を促進します。

このPF4の自然免疫的な役割は、ヘパリン存在下でのPF4に対する異常な免疫反応の説明に役立つと思われます。 抗菌の役割として、PF4は細菌表面のアニオン性成分に結合します。 細菌に結合したPF4は、患者の血清からHIT抗体を濃縮するのに使用できることが発見され、ヘパリン治療に反応して生成した抗体が細菌細胞上に露出したPF4エピトープと交差反応することが証明されています。 また、その逆も真なりで、微生物感染に反応して自然に生じる抗体は、PF4/ヘパリン複合体を認識するという証拠が蓄積されています。 PF4/ヘパリン反応性IgGおよびIgM抗体は、健常者の最大6%で検出されている。 歯周病菌に感染しているがヘパリンに暴露されていない健常者では、疾患の重症度に比例して測定可能なPF4/ヘパリン交差反応性抗体が検出される . また、ヘパリン曝露歴がなくとも臨床症状を呈し、HIT反応性抗体を獲得した患者、特に最近細菌感染した患者において「自然発症のHIT」が報告されている . したがって、内因性のPF4結合微生物標的に対する免疫反応によって、ヘパリン未使用患者におけるPF4/ヘパリン交差反応性抗体の発生や、重症患者や敗血症患者がヘパリン存在下でHITを発症するリスクがより高いという一般的な観察が説明できるかもしれません … これらの研究は、微生物に結合したPF4とヘパリンまたは血管細胞に結合したPF4の類似性を示唆しています。

内因性のPF4結合標的抗原が、抗凝固療法中にヘパリンによって生成される抗原と類似しているという概念を直接検証するには、多生物細菌敗血症モデルマウスを用い、細菌の曝露によって、典型的な一次免疫反応の時間経過とともにPF4／ヘパリン反応性の抗体が発現することを実証しています . これらの研究は、HIT抗体が、抗菌剤として機能するPF4によって惹起される自然発生的な抗体に類似している可能性があるという概念を支持するものである。 このことは、抗凝固療法がどのように抗体形成を誘発するかを理解するための背景を与えている。なぜなら、ヘパリンと複合体を形成したPF4や血管細胞の表面に発現したPF4の存在は、病原体に結合したPF4の提示を模倣し、保護的な自然免疫反応を誘発することが考えられるからである。

免疫アジュバントとしてのヘパリン

天然に存在する可溶性タンパク質は、経験的に免疫刺激剤として使用されてきたミョウバンまたは種々のオイルエマルジョンなどのアジュバントが存在しないと免疫原性が乏しい。 アジュバントは表面抗原エピトープを整理する。繰り返し規則正しく発現するタンパク質は、可溶性タンパク質よりもはるかに免疫原性が高く、B細胞受容体（BCR）を直接架橋する可能性がある ……。 ヘパリンは、PF4を密な間隔で、繰り返し、隆起した配列で表示し、高分子の繰り返しエピトープを形成している。 この点から、ヘパリンはPF4に対する自然免疫反応を引き起こすアジュバントとして機能する可能性があります。

免疫系の細胞は、toll-like receptor (TLR) を含む様々なパターン認識受容体 (PRR) を発現しています。 これらの受容体は、病原体群に特徴的であるが「自己」とは異なる病原体関連分子パターン（PAMPs）に反応し、限られた数の受容体が多種多様な病原体を認識することを可能にしている。 パターン認識受容体は他の免疫細胞へのシグナルを発する「脅威の探知機」です。 一般に使用されているアジュバントがPRRを活性化し、その有効性には自然免疫応答が中心であることが明らかになりつつあります。 実際、最近、ワクチン開発の効率を上げるために、PRRの新規リガンドを発見し、アジュバントとして使用することが注目されています。 特定のPF4/ヘパリン複合体は、病原性分子パターンとしてのPF4の抗菌性コンフォメーションを示し、これらの受容体を活性化する可能性がある。 ヘパリンはまた、IL-8、好中球活性化ペプチド-2、硫酸プロタミンなどのカチオン性結合パートナーの免疫原性を増大させる . マウス免疫実験では、ヘパリンが陽イオン性タンパク質であるプロタミンやリゾチームの免疫原性を高め、その免疫反応がPF4/ヘパリンセロコンバージョンに類似していることが証明されている . このように、ヘパリンは自然免疫パターン認識受容体のアゴニストとして働くペプチドモチーフを作り出すことによって、アジュバントとして機能するというのが一つの仮説である

TLR の活性化は自然免疫反応と適応免疫反応の両方に中心的な役割を果たしている。 特定の TLR は特定の病原体クラスに反応し、B 細胞抗体反応の大きさと微細構造を調整するサイトカインシグナルの文脈特異的でユニークなプロファイルを生成します。 このように、自然免疫によるPAMPsの認識は、最も効果的な適応エフェクター反応を活性化し、組織化するために、病原体の性質に関する情報を提供する。 リンパ球や樹状細胞が分化・増殖し、高親和性IgGを持つ形質細胞やメモリーB細胞になるには、受容体の関与が長く続くことが必要である . 一方、複製された病原体を迅速に中和するためには、TLRアゴニストを介した樹状細胞と特定のB細胞サブセットの活性化によって、より迅速な反応が引き起こされ、T細胞に依存しない経路でIgMだけでなくクラススイッチIgGとIgAを産生することができる … TLRとBCRの共刺激は、T細胞依存性抗体反応がピークに達するまで、病原体の負荷を抑制するための迅速な抗菌抗体反応を開始させることができます。 自然免疫反応と適応免疫反応のバランスは、抗原の濃度と曝露時間に依存すると思われます。 HIT の場合、PF4 標的抗原が持続的に高濃度で存在すれば、適応免疫応答がサポートされるかもしれません。一方、より短時間の曝露では、免疫記憶応答が欠如し、T 細胞依存性の抗体産生のみが行われるかもしれません。 HIT では、両方のタイプの免疫応答が確認されている。

予防/治療戦略

今日まで、HIT の予防や治療戦略は、未分画ヘパリンの使用を最小限に抑え、LMWH や直接トロンビン阻害剤を使用することに焦点が当てられてきました。 これらの代替抗凝固剤は、ヘパリンよりも高価で管理が複雑であり、効果的な逆転薬がないために出血のリスクが高いという重要な欠点がある。

上述のように、HIT抗体は、血小板減少や血栓症を引き起こす強い血小板活性化を引き起こすのに必要ではあるが、十分ではない。 血小板活性化免疫複合体の形成は、PF4標的抗原の利用可能性に依存し、したがって、HITのリスクは、激しいPF4放出によって特徴付けられる環境において最も高くなる。 PF4の利用可能性を最小にすること、あるいはPF4/ヘパリン複合体の形成を防ぐことが、HIT抗体の免疫発生と発症のリスクを回避する戦略であることは論理的である

こうした戦略の1つは、家族性高コレステロール血症の患者の観察から示唆された。 これらの患者は、食事療法やスタチン療法では十分なLDLコレステロールの減少が得られず、頻繁にLDLアフェレシス治療を受けることがある。 ヘパリンへの曝露が繰り返され、血管系疾患の素因があるにもかかわらず、この集団におけるHITの発生率は低い。 この観察に基づき、研究者らはアフェレーシス前後の血漿中および血小板表面のPF4濃度を調査した。 血漿および血小板表面のPF4は、アフェレーシスによって有意に減少した。 このことは、これらの患者が頻繁にヘパリンに曝露されているにもかかわらず、免疫原性が欠如していることを説明できるかもしれない。 さらに、これはHITのリスクの高い血清陽性患者において、抗原の利用可能性を減少させる治療戦略であることを証明することができた。 このような高度に秩序だった複合体では、ヘパリン結合により、抗原エピトープを形成するPF4四量体上の特定のアミノ酸に接近することができる。 最近の2つの研究により、アミノ酸置換や二量体-二量体界面を標的とした低分子阻害剤によってPF4の四量体組織が破壊されると、ULCの形成が阻害されることが示された。 PF4とヘパリンの複合体はHIT抗体によって認識されず、PF4アンタゴニスト分子はHIT抗体を介した血小板活性化を阻害した。 これらの研究により、PF4の標的抗原を変化させる、あるいは減少させる戦略は、HITの治療のための新しいアプローチにつながる可能性があることが示された

一般に、PF4がヘパリン由来の抗凝固剤と結合すると、抗原性エピトープが露出される。 ヘパリンは抗凝固作用に加え、強力な抗炎症作用を持つが、出血の危険性があるため、血栓症以外の適応症には使用できない。 ヘパリンの2-Oおよび3-O位を脱硫したもの（ODSH）は、抗炎症作用は維持されますが、抗凝固作用は低下します。 ODSHは、PF4と結合し複合体を形成する能力を保持しているが、HIT抗体の存在下で血小板活性化を引き起こさないことから、抗原性のPF4標的を露出させないことが示唆された。 ODSHはPF4との結合において固定化ヘパリンと競合し、細胞表面からPF4を追い出すことができる。 ヘパリンと併用することで、ODSHはin vivoでの免疫原性を低下させ、in vitroでのHIT抗体を介した血小板活性化を改善させる。 ODSHは、免疫原性複合体を生成することなく、利用可能なPF4の一部を封じ込めることができるため、PF4/ヘパリン比を抗原性の低い複合体へとシフトさせる効果的な方法であると考えられる。 さらに、ATの結合を阻害し、ヘパリンの中和を引き起こすPF4が少なければ、抗凝固作用が高まる可能性がある。 このように、ODSHの抗炎症性、非抗凝固性の特性は、他の抗凝固剤の安全性と有効性を高めるために有用であると考えられる。 特に、ODSHはすでにヒトに安全に投与できることを証明する試験を受けていることが利点である。 なぜなら、血小板の活性化は、抗体のみではなく、抗体と標的抗原の免疫複合体のみが媒介するからである。 本総説では、ヘパリンがアジュバントとして機能し、免疫細胞のパターン認識受容体のアゴニストであるPF4を病原体関連分子パターンとして認識されるモチーフで表示することで抗体形成を促進するという仮説を提示する。 PF4の封じ込めや構造変化を最小限に抑える技術は、HITの予防や治療に有効な臨床的介入方法の開発に向けた有望な研究分野である

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