Invasion Assay

材料：

Falcon 24 well tissueculture plate

Falcon Cell Culture Insert.を使用します。ポアサイズ8μm、24ウェルフォーマット

Cat# 3097

Matrigel (Diluted in DMEM/F12)

5% Glutaraldehyde in 1XPBS

0.5% Toluidine Blue、2% Na2CO3

Preparation of Boyden Chamber:

1. Using sterile forceps using cell wall inserts from their packaging and pit them into wells of a 24 wells plate.無菌鉗子を使用して、細胞壁インサートをパッケージから取り出して、24ウェルプレートのウェルにピットインします。
2. インサートを300μl DMEM/F12

（膜に刺さらないように注意）

1. 各セルウェルインサートの中央に1：6希釈マトリゲル20μl（タンパク質2-3mg/ml）を添加します。 マトリゲルをメンブレンの表面全体にゆっくりと広げます。
2. コートしたインサートをインキュベーターに入れ、20-30分間Matrigelが固まるのを待ちます。

Preparation of Cells for Assay：

1. 実験条件に従って細胞を処理し、増殖させます。 同じ増殖状態になるようにシンクロさせることが望ましい場合があります。
2. トリプシン処理と細胞のカウント
3. トリプシンを除去し、新鮮な培地で再懸濁します。
4. 1X105個の細胞を200μlのメデュームでアッパーチャンバーにプレーティングします。
5. 300μlのメデュームをLower Chamberに添加します。
6. 約20時間培養します。

培養時間は細胞株によって異なり、低浸潤性細胞では48時間まで可能です。

固定および染色：

1. 培養後、下段のチャンバーから培地を吸引し、1XPBS中の5% Glutaraldehyde 0.5 mlを添加、10分間インキュベートします。 4233>
2. Glutaraldehyde solutionを吸引し、D.W.
3. 0.5 % Toluidine Blue染色液0.5 mlをLower Chamberに添加、10-20分間インキュベート @ R.T.
4. Glutarldehyde solutionを吸引し、3回洗浄、10分間培養。T
5. 上段と下段のチャンバーから溶液を吸引し、下段をD.W
6. で3回洗浄し、綿棒で上段のチャンバーの内面を丁寧に拭き取ります。 (あまり強く押すとメンブレンが飛び出すことがあります）メンブレンの底の中央に侵入した細胞があります。
7. 顕微鏡の20倍の対物レンズで、細胞の数を数えます。 1枚の膜につき3フィールド以上カウントしてください。