Molecular Cloningは、原核生物または真核生物のソースから、プラスミドやウイルスベクターのような複製ビークルに組換えDNAを挿入するために使用される一連の技術である。 クローニングとは、遺伝子などの目的のDNA断片のコピーを多数作成することを指します。 このビデオでは、分子クローニングのさまざまなステップ、手順の設定方法、この技術のさまざまな応用について学びます。

クローニングを開始する前に、少なくとも2つの重要なDNA分子が必要です。 まず、最も重要なのは、クローニングしようとするDNA断片（別称、インサート）が必要なことです。 これは原核生物、真核生物、絶滅した生物に由来することもあれば、実験室で人工的に作り出されることもあります。 3539>

次に、ベクターが必要です。 ベクターとは、ある遺伝子のコピーを増やしたり、タンパク質を生産するために、分子生物学の道具として使われるプラスミドDNAのことです。 3539>

プラスミドは通常、マルチプルクローニングサイトまたはMCSを持ち、この部分には制限酵素としても知られるさまざまな制限エンドヌクレアーゼの認識部位があります。 ライゲーションと呼ばれる技術により、異なる挿入物をプラスミドに組み込むことができる。 プラスミドベクターには複製起点もあり、バクテリアの中で複製することができます。 さらに、プラスミドは抗生物質の遺伝子も持っています。 プラスミドを取り込んだバクテリアは、抗生物質を含む培地中で生き残ることができる。 3539>

インサートとベクターは宿主細胞生物にクローン化されるが、分子クローニングに最もよく使われるのは大腸菌である。 大腸菌は増殖が早く、広く入手可能であり、多数の異なるクローニングベクターが商業的に生産されている。 真核生物、例えば酵母もベクターの宿主生物として使用することができる。

一般的な分子クローニング手順の最初のステップは、任意の細胞型からDNAまたはmRNAに由来し得る、所望の挿入物を得ることである。 次に、挿入物の種類とそれを使って最終的に何を行うかによって、最適なベクターとその宿主生物を選択する。 ポリメラーゼ連鎖反応、またはPCRに基づく方法は、しばしばインサートの複製に使用されます。

その後、一連の酵素反応を使用して、インサートと消化物を結合し、宿主生物に導入して大量複製を行います。 複製されたベクターはバクテリアから精製され、制限消化の後、ゲル上で分析される。 ゲル精製された断片は、後に配列決定に回され、挿入物が目的のDNA断片であることが確認されます

では、分子クローニングがどのように行われるかをもう少し詳しく見ていきましょう。 クローニングを始める前に、ベンチでクローニングを試みる前に、クローニングの戦略を練っておきたいものです。 例えば、どのプラスミドベクターでも、マルチクローニングサイトを介してインサートを組み込むための制限部位は限られている。 インサートが切断されないように、インサートにない制限部位を選ぶ必要があります。 鈍端フラグメントとオーバーハングを持つフラグメントを結合せざるを得ない状況に陥るかもしれません。 その場合、klenowフラグメントを使用してブラントエンドライゲーションを行うことが、目的のベクターにインサートするための唯一の選択肢になるかもしれません。 3539>

分子クローニングのためのDNA源は、簡単な抽出技術により、ほとんどすべての種類の細胞または組織サンプルから単離することができます。 一旦単離されると、PCRを用いてインサートを増幅することができる。

一旦インサートが増幅されると、それおよびベクターの両方は、制限エンドヌクレアーゼとしても知られる制限酵素により消化される。

一旦消化されると、インサートおよびベクターをゲルで実行し、ゲル精製というプロセスで精製することができる。 ベクターに関して、このステップは、ゲル上で高分子量の汚れとして現れる傾向がある切断されていないプラスミドから、直鎖化プラスミドを精製するのに役立つ。

消化物をゲル精製した後、DNAリガーゼという酵素を介して、挿入物をプラスミドに結合または接合させる。

一般的には、インサートとベクターの比率が3対1になるようにライゲーションを設定するのが良いとされており、これにより少量のベクターだけが自己ライゲーションされるようになります。 ライゲーションが氷上でセットアップされると、14～25℃、1時間から一晩の間インキュベートされる。

次に、プラスミドベクターを複製する宿主に導入するために、形質転換が行われる。

形質転換後、細菌を抗生物質とともに寒天プレートにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。 プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含んでいるので、形質転換に成功すると、抗生物質の存在下で寒天プレート上で培養すると、細菌のコロニーができる。 個々のコロニーを形質転換プレートから採取し、番号のついたチューブに入れた液体培地に入れ、振盪培養器に入れて膨張させることができる。 液体培地は少量ずつ番号のついた寒天プレートに加え、残りの培養液はプラスミド精製に移行する。 最終的にプラスミドが精製されることになる細菌コロニーの同一性を示す番号付けは、プラスミド精製プロセスを通じて維持される。

精製されたプラスミドのサンプルは、次に制限酵素で切断される。 次に、消化物をロードし、インサートの存在を確認するためにゲル上で実行し、これにより、細菌コロニーが、自己結紮プラスミドではなく、インサートを含むプラスミドで形質転換されたことを確認する。 インサートを含むプラスミドで形質転換されたことが確認された細菌は、さらにプラスミドを精製するために展開される。 配列決定は、目的の遺伝子がクローニングされたことを確認するための最終的な検証ステップとして行われます

分子クローニングは、ほぼ無限のアプリケーションに使用することができます。 例えば、mRNAの鋳型を逆転写酵素で逆転写してcDNA（相補的DNA）を形成し、PCRでcDNAを増幅すると、分子クローニングはcDNAライブラリー（特定の細胞型によって発現するすべての遺伝子のライブラリー）の作成に使用することができる。

また、分子クローニングは、ある細菌株から一連の遺伝子または遺伝子群を取り出し、それらをプラスミドに再編成し、別の株で形質転換するために用いることができ、これにより、生合成経路全体を再現して複雑な分子を生産することができる。 変異は配列決定によって特徴づけることができる。 変異体遺伝子で形質転換した細菌を、異なる薬剤や化学物質で試験し、どの細菌コロニーが薬剤耐性を持つように進化したかを確認することができる。

分子クローニングのおかげで、レポーター遺伝子をDNAプラスミドに組み込むことができます。一般的なレポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（GFP）で、紫外線にさらされると緑の蛍光を発します。 また、アルファウイルスにレポーター遺伝子を挿入して、蚊への感染や細胞内での感染性を示すこともできます。

以上、分子クローニングに関するJoVEのビデオをご覧いただきました。 分子クローニングの仕組みと、この技術が分子生物学でどのように使われるかを理解していただけたと思います。 いつもながら、ご視聴ありがとうございました！

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