はじめに
アジ化ナトリウム(NaN3)は白色の結晶性の粉体で毒性が強い物質として分類される. その毒性は青酸カリに似ており、神経系、心血管系、目、皮膚などを傷つけます。 この毒性物質は摂取後急速に活性化し、摂取量にもよるが、経口摂取後数時間で主な作用が現れる(1,2)。 NaN3にさらされると、数分以内に吐き気、嘔吐、頭痛、落ち着きのなさ、めまい、脱力感、呼吸困難、心拍の乱れなど様々な症状が引き起こされる(3)。 この毒性元素を大量に摂取すると、直ちに痙攣、意識喪失、心拍数および血圧の低下、呼吸不全を引き起こし、最終的には死亡に至る(3)。 NaN3の作用機序として、チトクロメック酸化酵素-呼吸鎖複合体阻害が最も知られている(4)。 これまでの研究で、NaN3はCox IVの阻害剤であり、皮質ニューロンのアポトーシスを誘導し、カスパーゼ3依存性とチトクロムcの放出に関連することが明らかにされている(5)。 また、Nrfはミトコンドリア転写因子A(Tfam)をコードする遺伝子の活性を調節することにより、間接的に呼吸鎖遺伝子の発現レベルを調節している可能性がある。 Nrf-1/2、Tfam、peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) およびその他の共活性因子はPgc-1αシグナルカスケードを構成し、ミトコンドリア生合成と呼吸機能の転写制御ネットワークの中心的な役割を担っていると考えられている。 このシグナルカスケードでは、Pgc-1αはミトコンドリアDNAに直接結合するのではなく、まずNrf-1/2を活性化し、Nrf-1/2はTfamのプロモーターと結合してTfamを活性化し、ミトコンドリアDNAの転写と複製を誘発し、ミトコンドリアタンパク質の発現レベルを上昇させる(6)。 同時に、Pgc-1ααはCaN-、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMK)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、サイクリン依存性キナーゼを介するシグナル伝達経路によって活性化されると考えられる(7)。 本研究では、PC12細胞を用いてドーパミン神経細胞モデルを作成し、NaN3がPC12細胞のPgc-1α-関連経路に及ぼす影響とそのメカニズムについて検討し、培養PC12細胞におけるNaN3による毒性の有無およびその背景にあるメカニズムを明らかにすることを目的としています。
材料と方法
材料
Rat pheochromocytoma PC12細胞は中国科学院タイプカルチャーコレクションの細胞銀行(中国、上海)から購入した。 NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany) のストック溶液を滅菌生理食塩水に溶解して1Mストック溶液とし、その後、実験前に所望の濃度に希釈した。 TUNELアポトーシスアッセイキット(C1090),Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) アポトーシス検出キット(C1063),Enhanced adenosine 5′-triphosphate (ATP) Assay Kit (S0027) を用いて,1段階でのアポトーシスを検出した. JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay kit (C2006) および Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) は、Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China) から提供されたものである。
Cell culture and viability assay
PC12 cells are maintained in Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), Waltham, MA, USA)および10,000 U penicillinと10,000 U streptomycinからなる1%Antibiotic Antimycotic solutionを添加した。 PC12細胞の生存率は、Cell Counting Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Shanghai, China)を用いて測定した。 細胞は1×105/wellの密度で96wellプレートに播種した。 24時間培養後、細胞をNaN3(0-80 mM)で処理し、12、24、48、72時間培養して細胞傷害モデルを構築した。 その後、10μlのCCK-8溶液(Dojindo Molecular Technologies, Inc.)を各ウェルに加え、標準条件下(37℃、5% CO2)でさらに2時間培養した。 ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)により450 nmの吸光度を測定した。 細胞生存率は、6ウェルの平均光学密度により算出した。 実験は3連で行った。 DAPI染色したPC12細胞の核形態
PC12 細胞を0、10、20、40 mMNaN3 に24時間暴露した。 プログラム細胞死と非アポトーシス細胞死を区別するために、核を10μg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology)で染色した。 簡単に言うと、細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで30分間室温で固定した。 3回の洗浄後、固定した細胞をDAPI(1:5,000)で5分間染色し、PBSで洗浄した。 蛍光画像はLeica DMI蛍光顕微鏡(倍率400倍)で取得した。
アポトーシス率の測定
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (Beyotime Institute of Biotechnology) を使用して、製造者の説明に従って細胞のアポトーシスを決定した。 コントロールPC12細胞(0 mMNaN3)および10、20、40 mMNaN3に24時間暴露したPC12細胞のアポトーシス率をフローサイトメトリー(FC500;Beckman Coulter, Inc.、カリフォルニア州ブレア、米国)により測定した。 統計解析はSPSS statistical software v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA)で行った。
Measurement of mitochondrial membranepotential (ΔΨm)
ΔΨm is a significant parameter of mitochondrialfunction.これは、ミトコンドリア機能に関する重要なパラメータであり、細胞膜電位の測定に使用した。 これは、蛍光プローブであるJC-1による染色を用いて評価された。 実験は3回繰り返し、以下のように実施した。 対照PC12細胞は0 mMNaN3で処理し、実験PC12細胞は10、20および40 mM NaN3に24時間暴露した。その後、メーカーのプロトコル(C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China)に従って、細胞をJC-1を含む培地で37℃、20分間インキュベートし、洗浄バッファで3回洗浄してから血清を含まない新しい培地で細胞を回収した。 同時に、陽性対照を阻害剤であるcarbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone (CCCP) (10 µM) で37°C、20分間処理した。 その後,FCM(FC500; Beckman Coulter, Inc.)により赤/緑蛍光を測定した. 6011>
Measurement of reactive oxygen species(ROS) production
ROS in PC12 cells are assessed using a ReactiveOxygen Species Assay kit (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, China).赤色蛍光強度と緑色蛍光強度の比率は、δsmのレベルを表す。 細胞内活性酸素の発生は,蛍光プローブである2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)により評価した. 細胞内活性酸素はDCFH-DAを酸化して蛍光性化合物2′7′-ジクロロフルオレセイン(DCF)を生成し,DCF蛍光強度は活性酸素測定キットの指示に従い,生成した活性酸素の量と平行になると考えられる.陽性対照は特定濃度のロザップ(50 mg/ml)で処理し、対照PC12細胞は0 mMNaN3で処理し、実験PC12細胞は10、20および40 mM NaN3に24時間暴露した。さらに、PC12細胞を無血清DMEM(1:1000)に溶解したDCFH-DA(10 mM)で37℃、20分処理し、無血清DMEMで3回洗浄した。 ポジティブコントロールはRosupで処理し、ROS産生を誘導した。 活性酸素の生成量はFCM(FC500;Beckman Coulter, Inc.)で測定した。 平均蛍光強度(MFI)は活性酸素のレベルを表す。
Measurement of cellular ATP content inPC12 cells
Experiment is repeated in triplicate and performed as follows: 対照PC12細胞は0 mMNaN3で処理し、実験PC12細胞は異なる濃度(10、20、40 mM)のNaN3に24時間暴露した。その後、細胞ATP量は、製造元のプロトコルに従って、Firefly Luciferase ATP Assayキット(Beyotime Institute ofBiotechnology)を使用して測定された。
Western blot analysis
PC12 細胞を 0, 10, 20, 40 mMNaN3 に 24 時間暴露し、aprotease inhibitor を含む radioimmunoprecipitation assaylysis buffer (Beyotime Institute of Biotechnology) で溶解し、 13,362 × g, 4°C で 10 分間の遠心を行い上清を採取した。 その後、BCAキット(Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.)を使用して、タンパク質濃度を測定した。 等量のタンパク質 (90 µg) を 10 および 12% SDS-PAGE に供し、Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) を用いてポリフッ化ビニル膜 (0.45 µm) にトランスファーした。 0.5%ウシ血清アルブミンを含むTBSでブロッキングした後、0.5%ウシ血清アルブミンを含むTBSでブロッキングした。1%Tween-20(TBST)を用いて室温で2時間ブロッキングした後、膜をPgc-1α(Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1000), Tfam (Abcam;1:1000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc.) に対する1次抗体でインキュベートした。 Danvers, MA, USA, 1:500)、pan-calcineurin A(CaN;Cell Signaling Technology Inc.、1:1,000)、リン酸化(p)-CaMKII(Cell Signaling Technology、1:1,000)、p-p38 MAPK(Cell SignalingTechnology、Inc.; 1:1,000)、p-細胞外シグナル制御キナーゼ(Erk)1/2(Cell Signaling Technology, Inc.、1:1,000)、B細胞リンパ腫2(Bcl-2)関連Xタンパク質(Bax;Santa CruzBiotechnology,Inc.製)。 米国テキサス州ダラス;1:200)、Bcl-2(Santa CruzBiotechnology社;1:200)およびシトクロムc(Santa CruzBiotechnology社;1:200)を4℃で一晩静置した。 次に、膜をTBSTで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(ウサギ;cat.no. A0208;1:1,000;またはマウス;cat.no. A0216; 1;1,000; both Beyotime Institute of Biotechnology) を室温で1時間反応させた。 免疫反応性バンドをenhanced chemiluminescence system (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) で可視化し、Image J version l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA) で定量的に分析し、β-アクチンをローディングコントロールに選択した。 データは平均値±標準偏差の標準誤差で表した。 グループ間の差の統計的有意性は、一元配置分散分析とBonferroni post-hoc 検定によって決定された。 P<0.05は統計的に有意な差を示すとみなされた。
Results
NaN3 inhibits the growth of PC12 cells
NaN3 exposure on the proliferation of PC12 cellsの効果はCCK-8 assayによって評価された。 表1および図1A-Dから、NaN3は濃度依存的に細胞の生存率を低下させることがわかった。 80 mMのNaN3に72時間暴露すると、ほぼ100%の細胞が死滅し、NaN3が著しく細胞死を誘導し、NaN3の細胞毒性が用量および時間依存的に検出されることが示された。 20 mMのNaN3を24時間暴露したところ、PC12細胞は50%の細胞死を起こした。 そのため、24時間培養した細胞をその後の実験に用いた。
Table I.NaN3 suppress the growth of PC12 cells (n=6).NaN3 is in the growth of PC12. |
Cell morphology
DAPI stainingでは、異なる濃度のNaN3に暴露した後のPC12細胞の形態変化を蛍光顕微鏡で観察しました。 24時間NaN3に暴露した細胞核の断片化が観察され、細胞核の収縮とクロマチンの凝縮がコントロールに比べてNaN3の濃度に伴ってわずかに増加した。 また、アポトーシス細胞は正常細胞に比べて小さく、明瞭であった。 さらに、NaN3に暴露した細胞では、アポトーシス細胞の数および緑色蛍光の強度が増加した(図2)。 図3は、異なる濃度(0、10、20および40mM)のNaN3に24時間暴露したPC12細胞において、アポトーシス細胞の数がそれぞれ5.03、8.02、43.77および78.67%(P<0.05)であることを示している。 また、NaN3は用量依存的にアポトーシスを誘導することが確認された。
Changes in mitochondrial membranepotential (ΔΨm)
ミトコンドリアは一般的に細胞の生存率に関わる重要な制御器官と考えられている。 そこで、ΔΨmをミトコンドリア機能の指標として使用した。 PC12細胞をJC-1(電位依存的にミトコンドリアに蓄積する陽イオン性色素)で染色した。 NaN3 の濃度を上げると、少数の細胞で膜電位の安定した活性ミトコンドリアである赤色蛍光(J 会合体)が観察され た。 一方、緑色蛍光(J-モノマー)は、ΔΨmが損傷したアポトーシスミトコンドリアを表し、多くの細胞で観察され た。 6011>
NaN3 によるミトコンドリア活性酸素の蓄積
ミトコンドリアが細胞内の活性酸素の主要な供給源であり、活性酸素はアポトーシスシグナルを不活性化する重要な役割を果たすことがよく知られています。 そこで、NaN3誘発PC12細胞死における活性酸素の役割について追加で検討した。 Fig. 5によると、対照細胞および様々な濃度(0、10、20、40 mM)のNaN3に24時間暴露した細胞の蛍光強度は、3.65、6.99、18.63、39.0であった。35であり、NaN3曝露は対照群に比べミトコンドリア活性酸素の産生を有意に増加させた(P<0.05)。 この結果は、NaN3によるアポトーシスが細胞内活性酸素の産生を向上させることを示唆した。
NaN3 downregulates themitochondrial energy production of cellular ATP
ATP content in PC12 cells exposed to NaN3, the relative luminescence unit (RLU) was quantitatively determined by a luminometer.この結果は、細胞内でのATPの生成を抑制することを示しており、NaN3を曝露したPC12細胞は、相対発光単位を測定した。 図6より、NaN3はミトコンドリアのATP産生を抑制し、細胞内のATP量を徐々に減少させることがわかった(P<0.05)。
PC12細胞におけるPgc-1αおよびアポトーシス関連タンパク質の発現レベル
NaN3曝露後はコントロールと比べてタンパク質レベルのPgc-1α発現が有意に減少した(P<0.05)。 さらに、Nrf-1、Tfam、p-Erk1/2、Nrf-2、Cox IVは、様々な種類の細胞でPgc-1αdynamicsの下流標的としてよく知られている(8)。 本研究では、NaN3曝露が用量依存的にPgc-1αダイナミクスを有意に阻害することを確認した(P<0.01;図7A)。
加えて、NaN3曝露はBaxおよびシトクロムcの発現レベルを上昇させ、Bcl-およびプロカスペース-3の発現レベルは低下した(P <0.05) 。 Bax/Bcl-2の比率も対照群と比較して有意に増加した(P<0.05;図7B)。
CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK, p-p38 MAPKなどの他の重要メンバーのタンパク質発現レベルも評価した。 その結果、NaN3はCaNの発現を増加させ、CaMKIIとp38 MAPKのリン酸化をコントロール群に比べ促進したが、total CaMKIIとp38 MAPKの発現レベルには変化がなかった。 さらに、NaN3群におけるp-CaMKII/CaMKIIおよびp-p38/p38 MAPKの比率は、対照群のそれと比較して有意に増加した(P <0.01; 図7C)。
考察
NaN3がPC12細胞の増殖を阻害したかどうかを判断するには、対数期の処理細胞数を非処理対照細胞数で比較した。 20 mMのNaN3に24時間暴露したところ、細胞増殖は約75%阻害された。 従って、以降の実験ではこの濃度を使用した。 アポトーシスは、膜の剥離、細胞の収縮、クロマチンの凝縮、核の断片化、DNAの断片化など、細胞の形態変化を伴う(9)。 さらに、アポトーシスの核形態とアポトーシス速度を分析するために、細胞を0、10、20、40mMのNaN3で24時間処理した。処理後、細胞をDAPIとAnnexinV-FITC/PIで染色し、核の分布を分析した。 ミトコンドリアは、細胞内pHの維持や活性酸素の生成など多くの代謝機能に関与しており、細胞のアポトーシスを促進・制御している(10)。 細胞アポトーシスの特徴として、ΔΨmの損失、エネルギー産生(ATP)の減少、ミトコンドリア膜の透過性の増加などのミトコンドリアの変化が先行していることが挙げられる。 これまでの研究で、活性酸素はミトコンドリア呼吸鎖の損傷やΔΨmの喪失を引き起こし、これらは神経変性の過程で神経機能障害を媒介または増幅し、結果として神経変性疾患の発症につながることが示唆されている(11,12)。NaN3は、過酸化脂質を介してミトコンドリア膜の透過性電位を上昇させ、変性や興奮毒性を引き起こすことが知られており(13-15)、ミトコンドリア電気輸送チェーンのチトクロム酸化酵素の機能を阻害してATP生成を阻害することで主要な毒性を発揮する(4)。 本研究では、FCMを用いてPC12細胞におけるΔΨmと活性酸素の産生を同定した。 また、様々な濃度の NaN3 に曝露し、ミトコンドリアでの ATP 合成を検討した。 ミトコンドリア細胞死は、発生プログラム、DNA損傷、小胞体ストレス、成長因子や栄養不足、ウイルス感染、酸化ストレスなどの複数の刺激によって活性化されると考えられている(16)。 Pgc-1αは、増え続ける核内共調節因子ファミリーの一員として、多くの遺伝子を活性化し、エネルギー代謝に関わる遺伝子の発現レベルを調節している可能性がある。これらの共制御因子は、DNAに結合するのではなく、Nrf-1/2やTfamを制御し、遺伝子転写の誘導や抑制に必要な後続の生化学的相互作用を促進することにより、それらの転写能を調節する大きな多蛋白質複合体として存在・機能する(8)。 さらに、Nrf-1/2は、ミトコンドリアゲノムの転写と複製の制御因子である核内コードTfam A、B1、B2(それぞれTfam、Tfb1m、Tfb2m)を強力に誘導することにより、ミトコンドリアDNAコード遺伝子の発現も間接的に制御する(18)。 本研究では、まずPC12細胞において、Pgc-1ααファミリータンパク質(Pgc-1α、Nrf-1、Nrf-2、Tfam)およびCox IVの発現を調べ、NaN3によるアポトーシスにこれらのシグナルが関与しているかどうか検証した。 その結果、NaN3によるアポトーシスは、ミトコンドリアを介したシグナル伝達経路におけるPgc-1αfamilyタンパク質およびCox IVの発現量に関連していることが示唆された。 また、NaN3濃度を増加させると、これらのタンパク質の発現量は有意に減少し、アポトーシスの活性化と進展に関与している可能性が示唆された(6011)
逆に、複合体IVは皮質ニューロンの一次アポトーシスを誘発すると考えられ、カスパーゼ3依存性とチトクロムの放出が関連する(5)。 ミトコンドリアが細胞のアポトーシスを制御する重要な因子であることはよく知られている。 Bcl-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアアポトーシス経路の重要なイニシエーターである。 このファミリーには、アポトーシス促進タンパク質であるBax、Bcl-2 homologousantagonist/killer および Bcl-2-associated agonist of cell death、ならびにアポトーシス抑制タンパク質であるBcl-2 および Bcl-extra large (Bcl-xL) が含まれています。 健康な細胞では、Baxは不活性な細胞質タンパク質であるが、アポトーシス時にはミトコンドリア内に移行される。 Baxは、ミトコンドリア外膜に孔を形成し、そこからシトクロムcが細胞質へ放出され、カスパーゼ3が活性化されることにより、プロアポトーシス作用を発揮する(21)。 抗アポトーシス蛋白質Bcl-2およびBcl-xLは、ミトコンドリア膜の完全性を維持することによってBaxの機能を抑制し、シトクロムカンドの放出を防いでカスパーゼ3の活性化を抑制する(22)。 本研究では、NaN3はアポトーシス促進因子であるBaxとシトクロムcのレベルを増加させ、アポトーシス抑制因子であるBcl-2とプロカスパーゼ3のレベルを減少させたことから、PC12細胞のミトコンドリアアポトーシスシグナルがNaN3によって開始されることが示唆された。 例えば、運動や寒冷暴露により、細胞内Ca2+やcyclic adenosine 5′-monophosphate (cAMP) シグナルを介したストレスシグナルの制御下でPgc-1αco-activatorの発現が誘導される(23)。 Pgc-1αの転写は、CaMK、カルシニューリン、β-アドレナリン受容体/cAMP、p38MAPKの影響を受けている可能性がある(24-26)。 また、MAPK ファミリーに属する p38 MAPK は、細胞の増殖、分化、形質転換、アポトーシスに極めて重要な役割を果たしており、アポトーシスの活性化は、直接リン酸化を介して Pgc-1α を誘導する可能性がある (27). 本研究では、NaN3 が細胞内 Ca2+ ホメオスタシスと p38 MAPK に及ぼす影響を調べるために、Ca2+ シグナル経路(pan-calcineurin A と p-CaMKII/CaMKII) と p38 MAPK 経路(p-p38MAPK/p38 MAPK と p-Erk1/2)タンパク質の発現レベルを調査した。 その結果、NaN3投与群では、p-CaMKII/CaMKIIおよびp-p38MAPK/p38 MAPK比率が上昇し、p-Erk1/2レベルが減少した。このことは、NaN3がPC12細胞のアドース依存的なアポトーシスを引き起こし、その活性化がCa2+およびp38 MAPK経路と関連することを示唆している。 これらの実験結果から、NaN3はCa2+およびp38 MAPK経路を活性化することにより、PC12細胞のアポトーシスを誘導することが確認された。 我々の知る限り、本研究は、NaN3がCa2+/p-CaMKIIおよびp38 MAPKを含むPgc-1α-関連シグナル伝達経路を介してPC12細胞のミトコンドリア媒介性アポトーシスを誘導することを初めて明らかにした
まとめ:本研究は、NaN3がPC12細胞のアポトーシスを誘導することを示した。 NaN3曝露の根本的な毒性メカニズムを明らかにするために、一連のプロアポトーシスタンパク質(Baxおよびシトクロムc)と抗アポトーシスタンパク質(Bcl-2、プロカスパーゼ-3、p-p38 MAPK、p-CaMKIIおよびPgc-1α)の発現レベルを調査した。 その結果、プロアポトーシス蛋白質は、PC12細胞において、CaMKIIとp38 MAPKの活性化とリン酸化、Pgc-1αとプロカスペース-3の活性化を介してプロアポトーシス作用を発揮することが確認された。 このデータは、NaN3の作用機序を分子レベルで研究するための基礎となるものである。 今後は、NaN3投与前にミトコンドリア分裂阻害剤1(キナゾリノンの誘導体で、新たにミトコンドリア分裂阻害剤として同定)を添加して、PC12細胞のNaN3誘発アポトーシスを抑制する保護剤の神経保護効果を調べ、さらにそのメカニズムを明らかにすることが期待されます。
Funding
本研究は、中国国家自然科学基金(助成番号81571848)および江蘇省高等教育機関の重点学術プログラム開発による助成を受けたものである。
Availability of data and materials
The datasets used or analyzed during the presentstudy is available from the corresponding author on reasonablerequest.
Authors’ contributions
YZ and SZ conceived and designed the study.Author’s in Japan. YZ、JH、HX、TG、YWがデータを取得した。 YZ、JH、HXはデータを分析し、解釈し、原稿を作成した。 6011>
Ethics approval and consent toparticipate
Not applicable.
Patient consent for publication
Not applicable.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.本論文では、著者らと利害関係がないことを宣言している。
用語集
略語集
略語集。
NaN3 |
アジ化ナトリウム |
|
Cox IV |
コンプレックス IV |
|
Tfam |
ミトコンドリア転写因子A |
|
Nrf-1/2 |
||
CaN |
pan-…カルシニューリンA |
|
Pgc-1α |
||
PC12 |
rat pheochromocytoma |
|
ΔΨm |
ミトコンドリア膜電位 |
|
CCCP |
||
ROS |
FCM |
flow cytometry |
MAPK |
mitogen->MAPK |
ミトジェン活性化プロテインキナーゼ |
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