Research studies

研究では、EU作物の一つであるPisum sativum（エンドウ）について調べています。 エンドウは、エンドウ・エネーション・モザイクウイルス、エンドウ早期褐変ウイルス、およびポテトウイルスYグループ（Potyviridae）のさまざまなウイルスに感受性があります。 このうち、マメ黄斑モザイクウイルス、マメコモンモザイクウイルス、エンドウモザイクウイルス、エンドウ種子媒介モザイクウイルス（PSbMV）は、いずれも重要な病原体である。 特に、PSbMVについては、エンドウのすべての商業品種が感受性であることを研究してきた。 この感受性の高さは、このウイルスがアブラムシを媒介として植物から植物に感染するだけでなく、種子中で世代から世代へと垂直感染するという事実によって、さらに強化されている。 この特性は、エンドウの生殖質コレクションの深刻な汚染につながり、種子の発芽後すぐに作物に早期かつ広範囲な感染を与える非常に有効な手段となっている。 種子伝染効率がわずか0.1％の場合、1ヘクタールあたり107粒の種子を播くと1万人に感染することを考えると、種子伝染の重要性は明らかである。 現在、この問題に対しては、収穫後の種子サンプルのウイルス外被タンパク質の免疫検出による検査と、汚染された種子ロットの排除を効率的に行うことで対応している。 エンドウの種子感染率は0〜100％の範囲にあることから、我々は種子感染に対する抵抗性を改良エンドウの系統に導入できないか検討した。 種子透過がない系統や60-80％の系統間の試験交配や戻し交配では、抵抗性は優性遺伝するが、F2世代やBC2世代ではメンデル形質として分離しないことが明らかになった。

PSbMVに対する自然抵抗性は北アフリカとアジアからのエンドウの接ぎ木で確認されているが、今のところこれらの劣性遺伝子は商業系統に導入されてはいない。 遺伝子解析の結果、これらの遺伝子はポティウイルス特異性の異なる他の劣性遺伝子とエンドウゲノム上の2カ所でクラスター化していることが判明した。 PSbMV病理型PI、L-l、P4に対する抵抗性を付与する遺伝子sbm-1、sbm-3、sbm-4はそれぞれ第6染色体上に位置し、病理型L-lに対する抵抗性を付与するsbm-2は第2染色体上に位置している。 このことは、2番染色体と6番染色体間の局所的な遺伝子変換や転座を示唆しているが、他の証拠から、この2つの遺伝子クラスターは異なる起源と機能を持つ可能性が示唆される。 異なる病理型の間で作られた組み換えハイブリッドウイルスを用いて、ウイルスアビルランス決定因子はsbm-1のウイルスゲノムリンクタンパク質（VPg）と定義されるようになった。 sbm-1遺伝子の構造および機能解析は、デンマーク、フィンランド、スペイン、イギリスの研究グループおよび企業が参加するEC-バイオテクノロジープロジェクト#BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) のテーマである。

sbm-1遺伝子の特性解析は特に知的および実用的な報酬をもたらすであろう。 sbm-1がどのように機能し、何が隣接するsbm-や他のポティウイルス耐性遺伝子の特異性を制御しているのかを理解することは、様々な病気にとって重要である。 しかし、sbm-プロジェクトは技術的な課題も抱えており、特にエンドウ豆のゲノムの大きさと冗長性に対処しなければならない。 エンドウ豆のゲノムはハプロイドあたり約5×109塩基対であり、シロイヌナズナのゲノムの約50倍である。 エンドウ豆の遺伝子のマップベースクローニングはまだ達成されておらず、大規模なインサートライブラリーはまだ利用できない。 しかし、sbm-1には新しいクラスの抵抗性遺伝子を同定する可能性がある。 他の種からこれまでにクローニングされた抵抗性遺伝子は、2つのクラスに分類される。 特定のウイルス、菌類、細菌に対して機能する優性抵抗性遺伝子は、大きく分けて「NBS-LRR」クラスに分類され、感染に対する過敏な抵抗性を媒介する。 今回クローニングされた唯一の劣性遺伝子（mlo）は、オオムギのうどんこ病に対する非レース特異的抵抗性を媒介し、死細胞における病原体の局在化にも関連している。 機能的には、Mloは構成的抵抗性の負のレギュレーターとして働いている。 一方、sbm-1はレース（あるいはパスタイプ）特異的であり、細胞死とは関係しない。 これらの比較から、sbm-1の機能的なメカニズムがいくつか考えられる。 まず、Sbm-1はウイルスの複製を助けるために必要な優勢な感受性因子であると考えることができる。 このことは、VPgがウイルスRNAの複製に関与していると考えられること、また、抵抗性植物のプロトプラストではウイルス複製が検出されないという観察とも一致する。 第二に、Sbm-1はMloと同様に抵抗性の負のレギュレーターとして働くが、Mloとの特異性の違いから、Sbm-1は抵抗性遺伝子の異なるクラスに位置づけられると思われる。 第三に、sbm-1は優性だが用量依存的な弱い抵抗性対立遺伝子である可能性がある。 我々は、最も直接的で単純な解釈として、最初の選択肢を支持する。

EC-バイオテクノロジー・プロジェクトにおける我々のコンポーネントとして、我々はsbm-1耐性遺伝子産物を特定するために遺伝的アプローチを用いることを選択した。 エンドウの適切な系統（ホモ接合抵抗性と感受性対立遺伝子を持つBC4ペア）を特定した後、cDNA-AFLP戦略を使用して、導入領域から来る発現遺伝子を同定している。 これまでのところ、10個の多型性cDNAが同定されている。 これらの遺伝子は、ゲノム上の起源を確認するために、組換え近交系ファミリーを用いてマッピングされているところである。 我々の別の戦略は、PSbMV VPgを餌タンパク質とする酵母ツーハイブリッドシステムを使って、sbm-1遺伝子産物を「釣る」ことである。 2つの強力な候補cDNAと、相互作用タンパク質をコードする他の8つのcDNAが、感受性エンドウの系統から作られたエンドウcDNAライブラリーから同定された。 これらのcDNAは配列決定とマッピングも行われている。

デンマーク、フランス、イギリスの学術・産業パートナーが参加した以前のEC-AIRプロジェクト（# CT94-1171）の一環として、我々はトランスジェニックエンドウにおけるPSbMVに対するPDR開発の可能性も探求した。 他のシステムでは、転写後遺伝子抑制（PTGS）のプロセスを誘発することによってPDRを与えるために、ウイルス複製酵素遺伝子が一般的に使用されていたので、我々はエンドウでの遺伝子導入発現のためにPSbMV複製酵素シストロン（NIb）を使用した。 35Sプロモーター-Nib-35Sターミネーター構築物を持つAgrobacterium tumefaciens T-DNAで形質転換し、除草剤Bialophosの存在下で形質転換組織の選択マーカーとしてbar遺伝子を導入したエンドウ35系統から、PSbMVに対する抵抗性を示す3系統を選抜した。 これらの系統のうち2つはNib遺伝子（NIbIb）の3’末端を直接反復したものであった。なぜなら、複雑な導入遺伝子の配置はPTGSを開始する可能性がより高いという証拠がいくつか見られたからである。 これらの系統はすべて「回復」と呼ばれるタイプのPDRを示し、チャレンジ接種によって初感染が起こるが、植物は急速に回復して症状やウイルス蓄積を示さなくなった。 回復した組織は、同種または近縁のウイルス単離株による更なるチャレンジに対して抵抗性を示す。 植物が近縁のウイルス集団にさらされる可能性のある圃場でのこの意義を評価するために、PSbMVの異なる分離体がPTGSを誘発する能力および誘発PTGSによって標的化される能力を評価した。 この結果、NIbシストロンにおいて約89％以上の同一性を有するウイルスが抵抗性を誘導できることが示されたが、2回目のチャレンジウイルスが標的として見られるための特異性要件はより高い可能性がある。 参考までに、最も配列の異なる2つのPSbMV分離株は、Nib領域において89％の相違がある。 PTGSにおけるトリガーとターゲティングのための特異性要件のこの違いは、この技術を商業作物に適用するための重要な検討事項となるだろう。 Nib遺伝子導入エンドウのPSbMV分離株に対する比較的広い耐性は、天然のsbm耐性遺伝子に見られる極端な病型特異性とは対照的であり、ウイルスアビルレンス決定因子の1つまたはいくつかの変化だけでPSbMV分離株を無病から強毒に変えるのに十分である。

最初の感染期間が短いにもかかわらず、トランスジェニックエンドウ植物はチャレンジ接種後に良好な成長および種子形成を示し、非感染トランスジェニックまたは非トランスジェニック系統で見られたものと同等のガラスハウス条件下での収量を与えた。 我々は、形質転換植物の選抜のためのbar遺伝子の使用に関するライセンス契約を条件として、これらの植物が、新しい改良型エンドウ豆の系統の開発に使用される病原体抵抗性遺伝子のパネルに有用な追加物となりうると考える

トランスジェニックエンドウ植物は、ポティウイルスに対するPDRを示す最初のマメ科植物であり、PTGSを示す植物のマメ科における最初の実験例の一部でもある。 したがって、この系におけるPTGSと抵抗性を支配する原理が、より一般的に使用されている実験植物（例えば、ニコチアナ属）で特徴付けられるものと一致していることを確認することは貴重なことであった。 PTGS の予想通り、誘導されたウイルス抵抗性は、導入遺伝子 RNA と PSbMV RNA の分解に関連したものであった。 また、これらの植物では、PTGSはウイルス感染の初期段階で生成される全身性のシグナルによって媒介されること、およびこのシグナルは、NIbトランスジーンの転写領域におけるメチル化を誘導することによってPTGSの広がりを媒介する可能性を有することを示した。 これを達成するための最も穏当な方法は、従来の育種戦略を用いて天然由来の抵抗性（種子感染またはウイルス複製に対する抵抗性のいずれか）を組み込むことであろう。 PSbMV の種子伝染の遺伝的複雑さについての我々の理解は比較的浅いので、これは短期的には有用でないだろうということである。 sbm- 遺伝子はより有望であるが、密接に関連した遺伝マーカーがないことと、抵抗性が劣性であることから、いくつかの困難がある。 あるいは、トランスジェニック技術を応用して抵抗性を作り出す可能性もあるが、バイオセーフティと社会的受容性の問題に対処する必要がある。 これらの応用的な検討に加えて、この研究は、関連するアプローチを他の作物植物に使用する方法に影響を与える材料と知識を生み出しましたし、現在も生み出しています。 特に、新しいクラスのウイルス抵抗性遺伝子の作用機構を理解することは重要であろう

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