Discussion

本研究では、冒頭で述べた膠質血管のユニークな特徴の根底にあるか寄与すると思われる、付随ECとSMCの多くの異なる特徴を同定した。 閉塞のないベースライン時の側副血管のシアストレスは低く振動的であるにもかかわらず，側副血管のECは最遠位細動脈や下行大動脈の高速直交層流と同程度に血管軸方向に配列していることが分かった。 内皮細胞は細動脈血管ともに一次繊毛を有し、細動脈血管はその数が少ない。 平滑筋細胞はDMAと異なり連続的である。 DMAと比較して、炎症促進・抗炎症、増殖促進・抗増殖の経路に関連する遺伝子の発現が高い。 側副壁の細胞増殖率が高いということは、側副壁が胚で形成されて間もなく蛇行を始め、中年期（16ヶ月、49歳相当）まで増加するという観察からも支持される。

ベースライン時の側副血管の血流の収束は、その壁細胞に低くて「乱れた」フロー/シアストレス力を与える。すなわち、フローがないか、または平均ゼロで行ったり来たりする非常に低いフロー（1分間に約100回振動）である。 この結果、Bernoulliの関係に従って壁応力が増加する。 動脈循環の他の場所、例えば分岐部、大動脈内弓部、プラークの下流に存在する場合、低くて乱れたシアストレスは、酸化ストレス、炎症、老化マーカー、低eNOS/NO活性（すなわち、内皮機能不全）と関連する非アラインの石畳のEC形態に有利である … しかし、意外なことに、側副血行路のECはDMAや下行大動脈のECと同じ配列（および細胞の大きさ）であることがわかった。 我々は、この抗炎症性構造表現型がどのように規定されるのかについては調査しなかった。 我々が同定した他のユニークな特徴のうちの1つ以上が関与している可能性がある（下記参照）。 一方、図2の流量とシアストレスのデータは、麻酔をかけた動物で得られたものである。 覚醒時には、コラテラルが交差している動脈樹が供給する領域の代謝活動の変化により、一方向または他方向への持続的な流量が発生することがある。 このようにコラテラルが血流と酸素供給の生理的代謝調節、すなわち脳における神経血管のカップリングと他の場所での機能的充血に寄与しているかどうかは不明である。 しかし、このような一方向の流れが持続する期間には、我々が観察したECの配向を促進する可能性がある。 基礎的な原因にかかわらず、我々は、側副血管の整列した表現型は、側副血管の維持に有利で、その希薄化を緩和する一連の保護メカニズムの一部（またはマーカー）であると推測している（図9）。

私たちの知る限り、これは、側副血管と細動脈を裏打ちするECが一次繊毛を持つことを示した最初の報告である。 一次繊毛は健常者の導管血管で報告されたものよりはるかに多く（すなわち、ECの1％未満に存在しないか存在する）、DMAの28％に対し、側副子の18％が一次繊毛を持っている。 EC上の一次繊毛は、1984年にHaustによってウサギとアテローム性動脈硬化症のヒトの大動脈で報告された。 その後の報告では、20週齢のヒト胎児の松果体の毛細血管、心臓や大動脈弁の発育中、およびそれらの文献］、アテロームの周囲、ApoE-/-マウスの総頸動脈の異所性、および健常人の導管動脈の分岐部や大動脈弓の内曲部において繊毛を持つECが報告されている；一方、シアストレスの層状である動脈の領域では繊毛はないかほとんどない；このことは、動脈の領域にある繊毛は、シアストレスに対応することができない。 他のほとんどの細胞型は、発生時、細胞培養の特定の条件下、および成体でPrCを発現する。 細胞の種類によって、PrCは胚の非対称性の決定、中心核の配置、増殖／細胞周期の調節、オートファジー、流れを感知するメカノトランスダクション、化学受容、および繊毛質、細胞質、核質間でのシグナル伝達タンパク質の区画化と輸送（例えば、GliとPDGFRα）に関与している . 繊毛が存在する場合、非増殖細胞で最も多く、近位端はECや他の全ての細胞型ではないが、形質膜の侵襲（繊毛ポケット）に固定されている。 一次繊毛は、微小管組織化センター（MTOC）にリンクしている基底体の母遠心子と複合体になっている。 S期における繊毛の分解・再吸収と遠心分離は、細胞分裂に不可欠である。 PrCはMTOCを介して細胞骨格に連結されているため、流体によって誘発されるECの繊毛の屈曲は、細胞-細胞および細胞-マトリックスの接合部を含む細胞全体に伝達されることが可能である . 一次繊毛は、Pkd1とPkd2がコードするポリシスティン-1とポリシスティン-2が関与する、シアストレスに非常に敏感な経路を通じて、腎尿細管上皮細胞とECの流体シアストレスを伝達する。 ポリシスティン-1は機械感受性を持ち、ポリシスティン-2はTRPカルシウムチャネルである。 両タンパク質ともせん断応力を感知し、一酸化窒素を放出するのに必要である。 PrCの欠陥は多くの異常と関連している。 例えば、PKD1とPKD2の変異は常染色体優性多発性嚢胞腎の原因であり、患者の腎臓のECと尿細管細胞は、カルシウムとNOの応答の欠損と増殖の増加を示す。

細胞培養で層状せん断応力と増殖性静止状態を維持したヒト臍帯静脈ECでは、一次繊毛が欠如していることがわかった。 ヒト臍帯静脈では、内腔に突出した繊毛を持つECは1％未満であり、それ以上の割合で繊毛は細胞内に位置していた。 胚性大動脈とそこから培養したECには、内腔に突出する繊毛が1本ある。 内皮繊毛は、胚発生期の高せん断応力領域に存在し、せん断応力感受性転写因子KLF2の発現とともに、eNOSや他の抗炎症・抗増殖遺伝子を転写する。 シアストレスが低い、あるいは乱れた領域では、PrCは分解・消失し、Klf2およびeNOSの発現はそれぞれ消失・減少している。 Klf2の発現は、胚性動脈から単離された非繊毛性ECでも阻害され、培養中のECからPrCを化学的に除去しても同様の効果、すなわちKlf2の発現を消失させる . 興味深いことに、内皮機能障害を有するがプラークを形成しない成体ApoE-/-マウスのECでは、繊毛を持たない野生型マウスと比較して、層流が存在するにもかかわらず総頸動脈で繊毛が異所的に発現している . この繊毛は、流れを制限するギプスを血管に埋め込んで高せん断応力を誘発すると消失した。 野生型マウスの総頸動脈にキャストを埋め込むと、せん断応力が低く乱れた領域でのみ繊毛が形成された。 これらの知見は、成人の生体内におけるEC上のPrCの発現は、せん断応力の低い/乱れた領域に限られるが、高脂血症やおそらく他の血管危険因子による内皮機能障害が存在する層流の動脈では、異所的に発生しうることを示唆している。 特に、大動脈弓の内曲部やプラークの下流など、繊毛が多く、流れの乱れた部位では、約25％のECが単一の繊毛を持ち、残りは欠損しており、この割合は、我々が細動脈や側副血管で観察したものと同様であった。

健康な若年成体マウスの細動脈および膠質にもPrCが存在するという我々の発見は、これらの血管タイプにおける繊毛の機能を調べる研究の必要性を強調するものである。 これには、動脈血よりも側副血管の繊毛が少ないという我々の観察が機能的に重要であるかどうかの判断も含まれる。 内皮細胞は隣接するECやSMCと機械的、電気的、拡散的に結合しているので、機械的感受性や他のシグナルの伝達のために繊毛を発現する必要があるECはごく一部であろう。 高せん断応力は培養ECの繊毛の分解を引き起こすが、振動流の反転は繊毛の発現を誘導する。 我々は、細動脈および側副血管の繊毛は、細動脈では低いフロー/シアストレス、側副血管では非常に低い乱れたフローを反映していると考え、側副血管の繊毛が少ないことは、一般的な乱れたシアストレス環境に対する感度を下げる役割を果たしていると推測している。 言い換えれば、側副子上の繊毛の減少は、KLF2/4、eNOS、その他の抗炎症/抗増殖因子の発現の維持または増加を通じて、側副血管の血行動態の乱れが引き起こす低レベルの炎症、酸化的、増殖的、アポトーシス信号に対してバランスを取ったり対抗する適応のレパートリーの一部かもしれない（図9）。 すなわち、EC上のPrCの存在はKLF2の発現と関連しているので、内皮繊毛は、低流速で乱れた領域におけるECの活性化にブレーキをかけるシグナルを発している可能性がある、とEgorovaらは同様のことを提案している。 これらの領域における繊毛の保護的役割は、Ift88の条件付き欠失を用いて内皮繊毛を除去すると、高脂肪食を与えたApoe-/-マウスの動脈硬化と炎症遺伝子発現が増加し、eNOS活性が減少するという最近の報告や、Tg737 (orpk/orpk) 繊毛欠損マウスの動脈硬化になりやすい領域の内皮は骨形成分化に感受性が高くなることからも裏付けられる . また、もしPrCが保護的であるならば、側副血管のPrCが少ないことが、加齢や他の血管の危険因子による希薄化に対して、側副血管の高い感受性に寄与している可能性もある。 しかしながら、PrCの存在と基底体との結合は、細胞を細胞周期から除去することを促進すると考えられているので、側副血管の繊毛の減少は、例えば、側副曲率の漸増（後述）によって証明されるように、より高い固有の増殖率の結果であるなど、単に二次効果または傍観者効果を反映しているかもしれない … 我々が発見したEC上の多毛が、増殖性老化を経て細胞質分裂や核倍数性に失敗したECを反映しているかどうかを判断するには、今後の研究が必要である。

最近、発達中のマウス網膜のECは、低から中程度のシアストレスの領域で血管叢のリモデリング中に血管接続を安定化させるためにPrCに依存していることが示された。 内皮繊毛はゼブラフィッシュ胚で流れを感知し、動脈運命の血管への壁細胞の採用に関与し、正常な血管の形態形成に必要である。 コラテラルの数と直径は中年期から減少する。 この加齢による希薄化は、遺伝的あるいは薬理学的なeNOS/NO欠損や血管の危険因子の存在によって強く加速される . シアストレスの増大は急性または緩徐に進行する動脈閉塞に伴う側副血管の外向きのリモデリングを誘発する。 Pkd1+/-マウスや常染色体優性遺伝の多発性嚢胞腎の患者には内皮のeNOS/NOの機能不全がある . 今後、ポリシスティン-1のEC特異的ノックダウンを用いて、側副血行路PrCが上記の機能の一つ以上に関与しているかどうかを調べることが重要であろう。 1）ポリシスティン-1の欠損は毛様体機能の変化をもたらす、2）ポリシスティン-1はポリシスティン-2とともにPrCによるフローセンスに関与する、3）いずれかのタンパク質の変異体は多嚢胞性腎疾患を引き起こす、4）VHLがHif1αの分解におけるその役割とは無関係であるという証拠がある、など。 5）コラータ形成に必要なタンパク質Rabep2はGSK3βの新規基質であり、繊毛-基底体複合体に局在し、そのノックダウンにより繊毛形成が阻害される。 また、Pkd2やIft88などの他の繊毛タンパク質のノックダウンなど、繊毛の存在と機能に干渉する他のアプローチも検討する必要がある。

網膜を含む様々な組織でSMCがまばらで不連続な遠位細動脈とは対照的に（脳での研究は確認できなかった）、SMCはコラテラルで連続的であった。 これは、Bernoulliに規定されたように、コラテラルにおける流れの収束の結果として、流れの運動エネルギーが増大した位置エネルギー（経壁圧）に変換されることによって生じる周方向の壁応力の増大と釣り合うように、壁の厚さが適応的に増大するためではないかと推測された。 この壁応力の増加のバランスをとるためにSMCを助けることができる細胞外マトリックスの組成と量が、動脈血管に対して冠状動脈で異なるかどうかを調べることは興味深い。 注目すべきは、SMC の被覆率が高いにもかかわらず、側副血管は同じサイズの細動脈と比較して、緊張が強いというよりも弱いことであり、筋原性反応性がない-側副血管に特有の追加の特徴である。

側壁細胞が存在する血行動態の乱れと酸化促進の環境は、炎症、細胞増殖、老化、血管形成に関わる遺伝子の発現が遠位細動脈と側副血管の間で異なるかどうかを検討させることになった。 側壁は、炎症性、アポトーシス促進性インフラマソーム遺伝子Pycard、増殖促進性遺伝子Ki67、Pdgfb、Angpt2、抗増殖性遺伝子Dll4、分化した動脈型ECマーカー遺伝子Ephrinb2のmRNAレベルが上昇していた。 しかし、細胞周期阻害遺伝子であるp21、p27、p53の発現には差がなく、増殖、細胞周期停止、老化に関連する他の遺伝子（p16Ink4a、Ampk、Sirt1、テロメラーゼ）にも差がなかった。 ECやSMCの増殖に関連する遺伝子（Vegfa、Flk1、Clic4、Pdgfa、Flt1）、発生過程でコラテラル形成に必要な遺伝子（最初の3遺伝子の場合）、ECやSMCの分化や静止状態を規定するのに関わる遺伝子（Tgfb、Angpt1）の発現にも差はなかった。 上記の増殖促進遺伝子の側副血行路での発現の増加は、側副壁細胞が他の動脈血管に比べて高い増殖率を持っていることを示唆する、我々の屈曲度の測定結果と一致する：側副血行路は生後1日目までに明らかになり、中年まで増え続け、その後減少していった。 後者は、加齢に伴い側副血管の数と直径が減少するのと同じ時期に起こっていた。 これらの知見は、加齢に伴う側副血行路の稀薄化は、側副血行路が存在する血行動態の乱れや低血中酸素濃度環境による生涯増殖率の上昇により、側副血行路ECやSMCの増殖性老化とその後のアポトーシスによって引き起こされるという仮説を支持している（図9参照）。

側枝はeNOSの活性も上昇しており、これまでの研究で、老化や他の血管リスク因子によって引き起こされる側枝の稀薄化に対抗することが示されている。eNOS由来のNOは酸化ストレス、炎症、増殖、白血球接着、血小板凝集、細胞の老化を抑制し、SMC弛緩を促進する . シアストレスはeNOS由来NOの近接刺激であるため、シアストレスが低く乱れた環境にある側副血管のeNOS/NOが増加すると、側副血管の弛緩を促す因子の影響を軽減することができる（図9）。 同様に、ECシアストレス感受性転写因子Klf2およびKlf4が低流速で振動するにもかかわらず、側副血管の発現を維持し、流れの乱れた動脈血管系の他の場所でこれらの因子の発現が阻害されることは、eNOSの増加、整列したEC、少ない繊毛、強固なSMC被覆、エフリンB2およびDll4の増加と同様に追加の「バランス」因子として、または側副血管の特殊性として作用するかも知れない。 KLF2とKLF4の発現は、増殖、炎症、血管新生を負に制御し、eNOSをアップレギュレートし、低いシアストレスと乱れたシアストレスの部位で急激にダウンレギュレートするが、側副部とDMAで差はなかった。 興味深いことに、PrCはKlf2、Klf4、eNOSの発現を促進する。

上記の研究の限界は、RNAが解剖した血管から得られたものであることで、血管はEC、SMC、さらに少ないが周皮細胞、線維芽細胞、常在ミエロイド細胞で構成されていた。 細胞種を分離し、より多くの遺伝子とそのタンパク質量を調べる研究が必要である。 しかし、手作業で必要な数の側副血管と遠位動脈を切り離すことの難しさ、細胞分離技術がRNAとタンパク質のベースラインレベルに及ぼす影響、「側副」ECとSMCの細胞培養モデルがないこと、そして、まだ側副特有のマーカー遺伝子がないことから、これらのアプローチの使用は不可能であった。 しかし、注目すべきは、調べた遺伝子のうち、Flk1、Angpt1、Angpt2、Ephrinb2、DLL4、eNOS、Clic4、Klf2、Klf4など、いくつかの発現がECに特異的あるいは濃縮されている点である。 しかし、遺伝子転写の解析は必ずしもタンパク質レベルや機能の変化を反映するものではない。したがって、酸化ストレス、炎症、増殖、老化マーカーをタンパク質レベルで調査することは、細胞特性の違いをよりよく反映することができるかもしれない

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