Discussion

高塩分の摂取は心血管疾患のリスクである（Alves da Silva et al.2003)。 過去20年間の臨床的および実験的調査からの蓄積された証拠は、高血圧を含む腎臓および心血管疾患が胎児起源でプログラムされ得ることを示した（Guytonら1972、Hoyら1999、Woods 2000、Barker 2002、do Carmo Pinhoら2003、Logan 2006、Bagby 2007、Blacheら2007、Tayら2007, 2012, Gluckmanら2008)。 本研究は、妊娠中の高塩分摂取が胎児の局所腎RAS発達に及ぼす影響について、子孫への長期的影響との関連で新たな情報を提供した。

妊娠中のHSD摂取2カ月後、母体の血漿浸透圧とNa+値は成人のそれと同様に増加した（da Silva et al.2003）。 胎児の血漿浸透圧とNa+も妊娠中の母親の食塩摂取により上昇した。 観察された胎児の血中浸透圧とNa+濃度は、主に2つの原因によるものであると考えられる。 一つは母体循環塩が胎盤を通過することであり，もう一つはNa+レベルが上昇したときの胎児自身の調節に関連している可能性がある． そこで、胎内で意識のある動物とストレスのない動物で胎児尿値を測定した。 その結果、胎児尿量は有意に減少し、尿浸透圧、Na+、Cl-濃度、Na+：K+比は増加し、流量に対する胎児尿Na+：Cl-比も増加し、塩負荷チャレンジに直面して胎児腎系が機能したことが示された。 さらに、胎児の腎排泄に関するデータは、妊娠中の母親の塩分摂取が胎児の腎機能に影響を与えるという情報を加えた。

本研究では、胎児の腎臓と身体の重量はHSDによって統計的に変化しなかったが、腎臓重量：身体重量比は著しく減少し、他の可能性もあるが、高塩分の状況下で胎児の腎臓が比較的悪く発達したことが示された。 以前の研究では、妊娠中の他の環境的な侮辱が、胎児の腎臓の小型化や発育不良を引き起こす可能性があることが示された（Digby et al.） 今後、発育に関する研究では、食物摂取量の測定を検討する価値があると思われる。 塩分摂取の機能的影響を調べる一方で、尿量と電解質の変化は、胎児の体から過剰な塩分を除去するための急性防御機構であると思われる。 本研究では、胎児血清CREは有意に変化しなかったが、BUN濃度およびBUN：CRE比は上昇した。 BUNとCREは、腎機能の指標として一般的に用いられており（Mao et al.2010）、糸球体濾過と腎機能を反映することができる。 注目すべきは、本研究では、高塩分摂取に直面して、母体のBUNは上昇しなかったが、胎児のBUNは上昇したことである。 これは，胎児の腎機能が未熟であったことと関連している可能性がある（Drukker & Guignard 2002）。 腎臓重量：体重比の減少の証拠と合わせて、データは胎児の腎臓の発達が母親の食塩摂取によって影響を受ける可能性があり、食塩摂取に対する胎児の腎臓の能力は母親と異なるか、胎児の腎臓の機能は環境からの刺激に対してより脆弱であることを示唆している

腎機能の制御において内分泌経路は重要な機構である。 高塩分摂取により母体血漿ADHが増加することは不思議なことではない（Kjeldsenら、1985）。 浸透圧の上昇がADH放出を刺激することはよく知られているが、母親の食塩摂取により胎児の血漿ADHが有意に上昇することは新しい証拠であった。 ADHは、腎排泄を介して体液バランスに重要な役割を担っている（Ranadive & Rosenthal 2011）。 この神経生理学的ホルモンは、集合管のアクアポリンCD水チャネルの移動を誘導することによって水の透過性を増加させ、腎臓の集合管における水の吸収を増加させる役割を担っている（Nielsen et al.1995）。 このことは、本研究で母体の高塩分摂取時に胎児尿量が減少したことを説明できる。 また，ステロイドホルモンであるALDは，腎遠位尿細管と集合管に作用してナトリウムの貯蓄と水の貯留を引き起こすので，ALDの濃度も測定した． レニン-アンジオテンシン-ALD系は，腎機能制御における重要な内分泌経路である（Fitzsimons 1998）． 高塩分摂取は，成人モデルで示されたように母体の血漿Ang IIを減少させるだけでなく（Dingら 2010），循環中の胎児Ang II濃度も減少させた． 胎児のPRAと腎臓のレニンmRNAとタンパク質が変化していない証拠と合わせて、このデータは血漿中Ang IIの減少のメカニズムが腎臓の外にある可能性を示唆するものである。 経路の1つの可能性は、血漿中Ang IIの前駆体の主要な供給源である肝AGTの減少であるかもしれない（Fitzsimons 1998）。 しかし、この仮定は、母体および胎児のAng Iレベルが高塩分摂取後に変化しなかったという事実からは支持されない。 ACEはAng IをAng IIあるいはAng(1-7)に変換するのに重要であることから、高塩分摂取によって低下した胎児のAng IIレベルの根本的なメカニズムは、影響を受けた変換酵素に関連していた可能性が非常に高いと考えられる。 以前の研究（Stevens & Lumbers 1986, Boyce et al.2008）では、高塩分により成羊のレニンが減少することが示された。 レニンの結果の違いは、我々の実験と彼らの実験で使用されたHSDの条件の違いに関連している可能性がある。 Stevens & Lumbers (1986) とBoyceら (2008) は、HSD群では胎児の血漿ナトリウムや血漿浸透圧にほとんど差がなく、胎児の尿中ナトリウム排泄だけでなく尿中浸透圧にも変化がないことを示している。 しかし、牛のHSD（210g/日のNa+を40日間投与）は、胎児の血漿ナトリウムおよび浸透圧の上昇と関連していた（Rouffettら、1990）。 妊娠ラットでは、Deloofら(2000))が母体HSDによる胎児血漿ナトリウムの増加を認めている。 本研究では、母体と胎児のレニンレベルは同程度であり、高塩分摂取は浸透圧とNa+の上昇と関連していた。 これらの研究間の様々な結果は、食塩負荷の程度と期間に関連している可能性がある。 また、先行研究では、血漿中Ang II濃度の低下がALDの低下につながることが示唆された。 本研究では，血漿ALDは血漿ADHおよび胎児尿Na+/K+の増加との関連はみられなかった． Ang II以外の体液調節機構もALD値の調節に関与している可能性がある。

これらの胎児の変化が長期的な影響と関連しているかどうかは重要な問題である。 我々のデータでは、母羊と子羊が出生後にNSDに戻ったとき、15日齢と90日齢の血中Na+と浸透圧レベル、およびBUNとCRE濃度は対照と実験子羊の間で同じであることが示された。 90日目の体重と腎臓重量（90日目の体重を除く）、血漿中Ang I、Ang II、ALD、ADH濃度も変化がなかった。 しかし，腎臓重量：体重比は15日齢，90日齢ともに有意に低く，BUN：CRE比は出生前高塩分曝露児の方が高かった。 このことは、環境負荷による胎内変化の中には、出生後の条件を改善すれば元に戻るものもあれば、長期的な影響を受けて現れるものもあることを示しており、胎内腎の変化と出生後の健康との関係について新しい知見を加えるものである。

腎臓の局所RASは細胞増殖やアポトーシスに重要な役割を果たし（Xu et al. 2009）、腎臓内のRAS成分は腎臓の機能だけでなく、腎形成も媒介する（Woods & Rasch 1998、Guron & Friberg 2000）。 胎児腎の成長はAT1受容体を介して制御されることがある（Guron & Friberg 2000, Xu et al.2009）。 食事によるナトリウムの操作は、腎臓におけるAT1およびAT2の発現の臓器特異的な調節を誘導した（Ruanら、1997）。 本研究は、胎児腎臓における局所RASの主要要素（レニン、AGT、ACE、ACE2、AT1、AT2）の発現に対する出生前の高塩分摂取の影響を評価した最初の研究であった。 その結果、HSDに暴露された胎児および子孫の腎臓では、AGTのmRNAおよびタンパク質の発現が有意に増加したが、胎児および子孫の腎臓レニンのmRNAおよびタンパク質量には変化がなかった。 全身性RASにおいて、AGTは主に肝臓から、レニンは主に腎臓から分泌される（Pereira et al. 2009, 漆原 & 小堀 2011）。 レニンのmRNAレベル、タンパク質レベルともに変化がないことは、本研究で血漿レニンが変化していないという内分泌学的知見をさらに裏付けるものであった。 AGTは、レニンやACEといったアンジオテンシンペプチドの前駆体であり、異なるRASペプチドを産生するための2つの重要な酵素である（Shi et al.2010）。 レニンに変化はなかったが、胎児および子孫の腎臓におけるACEのmRNAおよびタンパク質レベルは著しく変化していた。 ACEはAng IをAng IIに変換し、ACE2はAng(1-7; Shi et al. 2010)の形成に重要な役割を担っている。 本研究では、腎臓のACEとACE:ACE2比が増加し、ACE2が減少したことは、腎臓の局所Ang IIが増加し、Ang(1-7)が減少した可能性を強く示唆するものであった。 成人では、Ang IIとAng(1-7)はともに腎臓の血行動態を制御する重要な役割を担っている。 ACEとACE2は、アンジオテンシンペプチドのレベルを制御する逆調節酵素である(Shi et al. 2010)。 我々の発見は、腎臓でのACE合成の増大とACE2を介したAngIIの代謝の減少、さらに腎臓でのAng(1-7)の減少への移行を示唆している。 妊娠中に使用されるACE阻害剤やAT1受容体遮断剤は胎児の腎形成不全を引き起こすことから、無傷でバランスのとれたRASが正常な腎臓の発達に重要であることがわかる（Jones et al.1990）。

本研究では、出生前のHSDs曝露後、胎児および子孫の腎臓でAT1の発現がmRNAおよびタンパク質の両方で、90日齢のタンパク質を除いて有意に増加し、AT2の発現も胎児腎臓で有意に増加したが、子孫ではそのような変化は消失していた。 しかし、子孫の腎臓におけるAT1：AT2 mRNAおよびタンパク質の発現比は有意に増加していた。 AT1の絶対的あるいは相対的な増加は、腎臓の細胞増殖とアポトーシスに寄与していると考えられる（Fitzsimons 1998, Mao et al.2009）。 本研究では、出生前HSDによって腎臓のAT1/AT2が有意に変化する可能性があることを明らかにした。 このことは、環境の影響による胎児のAT2発現の変化が、出生後には元に戻る可能性があり、環境の違いによって異なる出生後の腎臓が説明される可能性があることを示している。 さらに、尿管芽の伸長と分岐はAng IIによってAT1/AT2受容体を刺激することで増強されることから、RASが腎臓の発達を制御していることが示唆された（Estherら1996、Guronら1999、Guron & Friberg 2000）。 AT1受容体拮抗薬による妊娠中の発育腎の成長遅延は、アンジオテンシン受容体の発現の増加と関連しており（Kriegsmannら、2000）、胎児腎の成長もAT1受容体によって制御されていることが示唆された。 このことから、Ang IIは成長シグナルのパートナーとして、あるいは単独で腎臓の発達を調節し、腎臓の機能に影響を及ぼしていると考えるのが妥当であろう。

結論として，妊娠中のHSDは，腎局所RASおよびその受容体の主要な構成要素のmRNAおよびタンパク質の発現の有意な変化と関連して，ADHシグナルを介した胎児尿排泄および胎児腎機能に影響を与えることが示された． この結果は、妊娠中のHSDsへの慢性的な曝露による腎臓の微妙な病態生理学的変化に関する情報を提供するものである。 今後、このような変化の原因となる分子標的の解明が進めば、胎児期の腎疾患や心血管疾患の早期予防・治療への新たなアプローチにつながる可能性がある

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