Cell culture, virus amplification and purification for SHAPE-MaP and SPLASH experiments
Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) および Madin-Darby canine kidney (MDCK) cellを2 mM l-glutamine and 10% FCS添加 Minimum Essential Medium (Merck) にて増殖させた。 WSN（H1N1）ウイルスのストックは、0.01の感染多重度（MOI）でインフルエンザウイルスをMDBK細胞に感染させることによって製造した。 ウドーン（H3N2）およびPR8（H1N1）（PR8）ウイルスのストックは、n-トシル-l-フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）処理トリプシン（メルク）の存在下でMDCK細胞を0.8μg ml-1で感染させて産生させた。 ウイルスは感染後2日で回収した。 ウイルスは超遠心分離によって精製した：まず、感染した細胞培養液を4,000 r.p.m.で10分間、4℃で遠心分離し、続いて10,000 r.p.m.で15分間、4℃で遠心分離することによって清澄化した。 次に、ウイルスを、SW 32ローター（Beckman Coulter）において25,000 r.p.m.で4℃、90分間、30％ショ糖クッションを通して遠心分離することにより精製した。 精製したウイルスペレットを再懸濁バッファー（0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 0.0001 M EDTA）中に再懸濁した。 ビリオンもRNAの三次構造も超遠心分離では破壊されないことに注意する30,31,32。
SHAPE-MaP
SHAPE-MaP は公表されているプロコトル17に従って行った。1-メチル-7ニトロイソトニックアンハイド（1M7）は以前に記載したように4ニトロイソトニックアンハイドから合成された33。 in vitro transcribed RNA 実験では、HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) を用いて、線状 DNA テンプレートから各ウィルス RNA セグメントを合成した。 生成物は、3.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）-尿素ゲル上でサイズと純度を確認した。 裸のウイルスRNAサンプルは、前述のようにスクロースクッション上でWSN粒子を精製することによって調製した。 精製したウイルスを250 μg ml-1のプロテイナーゼK（Roche）、プロテイナーゼK緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% SDS）で37℃、40分処理した。 改変前に、in vitro転写RNAおよびネイキッドウイルスRNAサンプルをフォールディングバッファー（100 mM HEPES-NaOH, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2）中で37 ℃、30分間フォールディングした。 1M7 (無水ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解; Merck) を最終濃度 10 mM になるようにフォールディング RNA に加え、サンプルを 37 ℃で 75 秒間インキュベートした。 インビリオ改変は、精製ウイルスに直接1M7を添加することで行った。 SHAPE-MaP試薬がウイルス粒子に浸透する能力は、最初に、NAセグメント標的化プライマー（5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′）を用いてSHAPE-MaP試薬処理したウイルスから抽出したRNA上で32P標識プライマー伸長を実施することによって以前に記載した34ように試験された。 1M7処理サンプルと並行して、対照サンプルをDMSOで処理した。n-メチルイサトイック無水物（NMIA；Thermo Fisher Scientific）SHAPE-MaP試薬もビリオで試験された。 NMIAを用いた実験は、精製ビリオンをNMIAで45分間処理した以外は、1M7について記載したように行った。
配列決定ライブラリー調製は、ランダム化ワークフローに従って、以前に記載したように実施された17。 簡単に言うと、1M7またはコントロール処理後、RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research)を使用してRNAを精製した。 RNAを、MaP緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol and 0.5 mM deoxynucleoside triphosphate）中でSuperScript II (Invitrogen) とともにRandom Primer Mix (New England Biolabs) を用いて逆転写させた。 Nextera XT DNA Library Prep Kit（Illumina）を使用してDNAライブラリを調製した。 最終的なPCR増幅産物は、Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) を用いてサイズ選別し、Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies) 上の Agilent DNA 1000 kit (Agilent Technologies) で品質評価した。 WSN、ネイキッドウイルスRNA、in vitro転写RNAについては、HiSeq 4000 System (Illumina) でライブラリのシーケンス（2 × 150 base pairs (bp) ）を行い、PR8とUdornウイルスについては、NextSeq 500 System (Illumina) でライブラリのシーケンス（1 × 150 bp) を行った。
SPLASH
SPLASH サンプルは、WSN、PR8、Udornウイルスの各2複製とH3N2再勧誘ウイルスの各1複製について、いくつかの修正を加え、以前に発表された24,35と同様に準備した。 精製ウイルスを200μMのEZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) および0.01% digitonin (Merck) とともに37℃、5分間インキュベートした。 ウイルスを6ウェルディッシュに広げ、ガラス板で覆い、氷上に置き、UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific)を用いて45分間照射した。 架橋されたウイルスをプロテイナーゼKで処理し、TRIzol（Invitrogen）を用いてウイルスRNAを抽出した。 抽出したウイルスRNAのアリコートを、Hybond-N Nylon Membrane (GE Healthcare Life Sciences) 上のChemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) を用いてビオチン取り込みを検出するために使用した。 抽出した残りのウイルスRNAは、NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) を用いて断片化し、RNA Clean & Concentrator-5 Kitを用いて200 ntより短い断片をサイズ選択した。 サンプルは、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads (Thermo Fisher Scientific) を用いてビオチン化ウイルスRNAを濃縮した。ビーズ上での近接ライゲーションとプソラレン交差リンク反転は、既報24、35と同様に実施した。 配列決定ライブラリーは、市販のSMARTer smRNA-Seq Kit（Clontech Laboratories）を用いて調製した。 最終的なサイズの選択は、PCRで増幅したシーケンスライブラリをTris/ホウ酸/EDTA（TBE）中の6% PAGEゲル（Thermo Fisher Scientific）で行い、200-300 bpのDNAを選択した。 ライブラリーはNextSeq 500 Systemで1×150 bpのシーケンスを行った。
Processing of SHAPE-MaP sequencing reads
シーケンスリードはSkewer v0.2.2 (ref. 36) でアダプターを取り除くためにトリミングされた。 SHAPE-MaP反応性プロファイルは、公開されているShapeMapper2パイプライン37を使用して作成した。 変異率は、次に以下のように定義されるSHAPE-MaP反応性値に変換される：
SPLASHシーケンスリードの処理
シーケンスリードはSkewer v0.2.2 （文献36）でアダプターを除去して切り出した。 STAR v.2.5.3 (ref. 38) を用いて、適切なウイルス参照ゲノムにリードをアライメントした（補足表2）。 このとき、少なくとも20 ntが参照ゲノムと一致するキメラリードのみを使用した（STARパラメータ：-chimSegmentMin 20）。 キメラリードは、CIGAR文字列とアライメント位置を用いて重複排除を行った。 各リードアライメントに含まれるCIGAR文字列を処理し、リードの開始・終了座標を求めた。 キメラリードの座標は、Rソフトウェアで配列相互作用のマトリックスを作成するために使用された。 このマトリックス中の個別の遺伝子座を選択し、リードのオーバーラップ強度に基づくガウス曲線で個別にフィットさせ、相互作用ウィンドウを定義した。複雑に重なり合う遺伝子座の相互作用ウィンドウは、個別のウィンドウに分離された。 相互作用ウィンドウの幅から各相互作用の開始座標と終了座標を決定し、この領域内（または部分的に領域内）にあるリードの数を相互作用頻度の指標として使用した。 図の作成には、R v.3.5.1 の circlize package v.0.4.5 (ref. 39) を用いて、各ウイルスにおける上位20個の相互作用を視覚化した。 相互作用遺伝子座の完全なセットは、補足表2に記載されている。 相互作用遺伝子座のqPCR検証のために、前述のようにpsoralen-cross-linkしたサンプルを調製し濃縮したが、より長いRNA断片を生成するために断片化時間を短くした（3分対4分）。 RNAをPoly(A) Polymerase (Takara Bio)でポリアデニル化し、smRNA dT Primer (Takara Bio) と PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) を用いて、製造者の指示に従って相補DNAを生成させた。 Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) とセグメント間相互作用を調べるためのプライマー対を用いて、StepOnePlus装置 (Applied Biosystems) で製造者の指示に従って50サイクルのqPCRを実施した。 プライマーの配列は、補足表3に示す。 qPCR増幅を50サイクル行った後、生成物を8％PAGE（29：1アクリルアミド／ビスアクリルアミド、1×TBEバッファ）で分離し、青色光透過照明で可視化した。
RNA構造予測
The IntaRNA algorithm v.2.3.1 (参考文献40) を用いて、Exact mode (-mode E) と no seed constraint (-noSeed) オプションを用いて、SPLASH解析で特定した領域で発生するRNA-RNA相互作用の能力を予測しました。 RNA-RNA相互作用のモデリングには、SHAPE-MaPの反応性を含めた（-tShapeおよび-qShape）。 SPLASHで同定した特定の相互作用パートナーをランダムにシャッフルしてPermutatedデータセットを作成し、IntaRNAを用いて相互作用ΔGエネルギーを評価した。 SPLASHで同定した分子間RNA相互作用に関連するΔGエネルギーの確率分布と並べ替えデータセットの差の有意性は、RソフトウェアのWilcoxon rank-sum検定を用いて計算されました。 次に、IntaRNAの構造予測を用いて、相互作用領域を塩基対形成に関与するヌクレオチドにトリミングしました。 SHAPE-MaP データが利用できない場合 (PR8 reassortants with H3N2 virus) は、IntaRNA で各 RNA 鎖のプリフォールディング (「アクセス性」) を無効にした (-qAcc = N -tAcc = N)。 既知の構造に対する検証のため、80Sリボソームの低温電子顕微鏡構造42 (PDB: 6EK0) とU4/U6.U5 triple small nuclear ribonucleoprotein spliceosomal complex43 (EMDB: EMD-2966) に基づいてRNA3Dhubデータベース41からRNA二次構造データを抽出した。 参照 RNA の配列は、リボソーム RNA と U4/U6 small nuclear RNA のウシ (MDBK) の配列と一致するように、以前に記述したように修正した44。 RNA の分子内構造予測には ViennaRNA package v.2.0 (ref. 45) を使用した。 RNAfold コマンドを使用して、各セグメントについて RNA 二次構造および分割関数を予測した。 SHAPE-MaP反応性を擬似エネルギー拘束として取り入れた。 T7転写RNAとvRNP関連RNAの間のSHAPE-MaP相関の程度を決定するために、ex virioとin virio SHAPE-MaP反応性プロファイル間の50 ntスライドメジアンウィンドウ相関分析を使用した。 その結果、>150 ntでは相関がないことがわかった。したがって、構造および分割機能予測における最大ペアリング距離制約を150 ntに設定した。
インフルエンザウイルスのリバースエンジニアリングのための細胞培養
MDCK 細胞とヒト胚性腎臓 (HEK 293T) 細胞は、メルボルン大学微生物学・免疫学部の既存のコレクションから供給されたものである。 MDCK細胞はRoswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培地（Sigma-Aldrich）で、HEK 293T細胞はDMEM（Thermo Fisher Scientific）で増殖させた。 両培地とも、10％熱不活性化FCS、2mM l-グルタミン、2mMピルビン酸ナトリウム、24μg ml-1 ゲンタマイシン、50μg ml-1 ストレプトマイシンおよび50IU ml-1 ペニシリンを添加した。 トランスフェクションのためのMDCK細胞とHEK 293T細胞の共培養は、50μg ml-1 ストレプトマイシンおよび50 IU ml-1 ペニシリンを含むOpti-MEM (Thermo Fisher Scientific) 中に樹立した。
リバースエンジニアリングしたインフルエンザウイルスの構築
PR8、Udorn、Mem71（H3N2）、PC73（H3N2）およびWyo03（H3N2）ウイルスからの個々の遺伝子セグメントを逆転写し、pHW2000プラスミドにクローニングした46． PR8ウイルスの6つのセグメント（PB2、PA、HA、NP、M、NS）からなる遺伝的背景に、PR8、Udorn、Mem71、PC73、Wyo03のいずれかのPB1遺伝子と野生型または改変型NA遺伝子を含む逆遺伝学由来のウイルスであった。 改変型NA遺伝子（Wyo03UdSub）はWyo03に由来し、Udorn-NA配列に対して4つの置換（ヌクレオチドG943A；C938U；U933C；およびG923A）を有していた。 これらの4つのヌクレオチドのうち3つはサイレントであり、4つ目（A534G）は保存的なリジンからアルギニンへの変化（K172R）をもたらすものであった。 これらの変化を組み込んだ相補的な断片をPCRで生成し、BsmBI制限部位47を含むセグメント特異的プライマーを用いたもう一回のPCRで結合した。生成物をウイルスレスキュー用のpHW2000発現ベクターにクローニングした。 プライマーの配列は補足表3に示す。 救出したウイルスは、10日齢の胚盤鶏の卵で増幅させた。 感染性アラント液は、MDCK細胞48でのプラーク形成によりウイルス含量を滴定し、-80℃で保存した。
リバースエンジニアリングしたウイルスのウイルス複製動態の決定
MOI0.01でMDCK細胞を感染させ、リバースエンジニアリングしたウイルスの複製特性を測定した。 1時間の吸収後（t＝0時間）、接種物を除去し、細胞を洗浄し、2mM l-グルタミン、2mMピルビン酸ナトリウム、24μg ml-1 ゲンタマイシン、50μg ml-1 ストレプトマイシン、50IU ml-1 ペニシリンおよび1μg ml-1 TPCK処理トリプシン（ワージントン生化学株式会社）を補充したRPMI1640中で37℃、5％CO2でインキュベートした。 細胞培養上清は、感染後の様々な時点で採取し、分析のために-80℃で保存した。 ウイルス力価は、MDCK細胞のコンフルエント単層上でのプラーク形成によって決定した。
インフルエンザウイルスの9プラスミド競合リバースエンジニアリング
インフルエンザウイルスの競合リバースエンジニアリングを、以前に記載したように8プラスミド逆遺伝システム26の修正バージョンを用いて実施した25。 簡単に説明すると、PR8のPB2、PB1、PA、ヘマグルチニン（HA）、核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M）、非構造タンパク質（NS）ウイルスRNAセグメントをコードするプラスミドを、Udorn、Mem71、PC73、野生型または改変Wyo03のいずれかのノイラミニダーゼ（NA）ウイルスRNAおよび競合PB1ウイルスRNAをコードするプラスミドと共に同時トランスフェクションさせた。 各プラスミド（1μg）をOpti-MEM中でFuGENE 6 transfection reagent（Promega）と混合し、HEK 293T細胞およびMDCK細胞の共培養に添加した。 トランスフェクション後6時間目に、培地を50μg ml-1 ストレプトマイシンおよび50 IU ml-1 ペニシリンを添加したOpti-MEMに交換した。 24時間後、TPCK処理したトリプシン（1μg ml-1）を加え、さらに42時間後に上清を回収し、-80℃で保存した。 競合するPB1遺伝子の組み込み頻度を決定するために、トランスフェクション上清中の子孫ウイルスをMDCK細胞におけるプラークアッセイに供した。 無作為に選んだプラーク（実験あたり約36個）をアガロースを通してサンプリングして選び、0.05％Triton-X100に再懸濁した。 競合する遺伝子セグメントのソースは、SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kit（Bioline）を用いた遺伝子特異的定量RT-PCRによって同定された。 各20μlの反応は、5μlのプラークピックウイルス懸濁液、10μlの2×SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix、0.2μlの逆転写酵素、0.4μlのRibosafe RNase inhibitor、各10μM gene-specific forward and reverse primer 0.8 μlおよび各25μM gene-specific probe 0.08 μlを用いて実施された。 プライマーとプローブの配列は補足表3に示す。 RT-PCR反応を45℃で10分間インキュベートした後、製造者の指示に従ってqPCR増幅を進めた。 報告された値は、各競技について3〜8回の独立したトランスフェクション実験からの結合データである。
報告概要
研究デザインに関するさらなる情報は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryで入手可能である。