Cultivo de células, amplificación y purificación del virus para los experimentos SHAPE-MaP y SPLASH

Las células de riñón bovino de Madin-Darby (MDBK) y de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) se cultivaron en un medio esencial mínimo (Merck), complementado con 2 mM de l-glutamina y un 10% de FCS. Se produjeron stocks de virus WSN (H1N1) infectando las células MDBK con el virus de la gripe a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. Los stocks virales de los virus Udorn (H3N2) y PR8 (H1N1) (PR8) se produjeron infectando células MDCK a una MOI de 0,001 en presencia de 0,8 μg ml-1 de tripsina tratada con n-Tosil-l-fenilalanina clorometil cetona (TPCK). Los virus se recogieron 2 días después de la infección. Los virus se purificaron por ultracentrifugación: en primer lugar, el medio de cultivo celular infectado se clarificó mediante centrifugación a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 °C, seguida de centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 15 minutos a 4 °C. A continuación, el virus se purificó mediante centrifugación a través de un cojín de sacarosa al 30% a 25.000 r.p.m. durante 90 minutos a 4 °C en un rotor SW 32 (Beckman Coulter). El pellet de virus purificado se resuspendió en un tampón de resuspensión (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Observamos que ni las estructuras terciarias del virión ni las del ARN se interrumpen por ultracentrifugación30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP se llevó a cabo de acuerdo con los procotolos publicados17; el anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7) se sintetizó a partir del anhídrido 4-nitroisatoico como se ha descrito previamente33. Para los experimentos de ARN transcrito in vitro, cada segmento de ARN viral se sintetizó a partir de una plantilla de ADN lineal utilizando el HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Se comprobó el tamaño y la pureza de los productos en un gel de electroforesis de poliacrilamida (PAGE)-urea al 3,5%. Las muestras de ARN viral desnudo se prepararon purificando las partículas de WSN sobre cojín de sacarosa como se ha descrito anteriormente. Los virus purificados se trataron con 250 μg ml-1 de proteinasa K (Roche) en tampón de proteinasa K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) durante 40 min a 37 °C. Antes de la modificación, las muestras de ARN transcrito in vitro y de ARN viral desnudo se plegaron a 37 °C durante 30 min en tampón de plegado (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Se añadió 1M7 (disuelto en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO; Merck)) a una concentración final de 10 mM al ARN plegado y las muestras se incubaron durante 75 s a 37 °C. Las modificaciones in virio se realizaron añadiendo 1M7 directamente al virus purificado. La capacidad de los reactivos SHAPE-MaP para penetrar en las partículas virales se probó inicialmente como se ha descrito anteriormente34 , realizando extensiones de cebadores marcados con 32P en el ARN extraído del virus tratado con el reactivo SHAPE-MaP utilizando un cebador dirigido al segmento NA (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Paralelamente a las muestras tratadas con 1M7, las muestras de control se trataron con DMSO. El reactivo SHAPE-MaP de anhídrido n-metilisatoico (NMIA; Thermo Fisher Scientific) también se probó en virio. Los experimentos con NMIA se realizaron como se describió para 1M7, excepto que los viriones purificados se trataron con NMIA durante 45 min.

La preparación de la biblioteca de secuenciación se llevó a cabo como se describió previamente17 según el flujo de trabajo randomer. En resumen, tras el tratamiento con 1M7 o con el control, el ARN se purificó utilizando el kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research). El ARN se transcribió en sentido inverso utilizando el Random Primer Mix (New England Biolabs) con SuperScript II (Invitrogen) en tampón MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiotreitol y 0,5 mM desoxinucleósido trifosfato). Se utilizó el Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) para preparar las bibliotecas de ADN. Los productos finales de amplificación de la PCR se seleccionaron por tamaño utilizando Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) y se evaluó su calidad con el kit Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) en un sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Para el WSN, el ARN viral desnudo y el ARN transcrito in vitro, las bibliotecas se secuenciaron (2 × 150 pares de bases (pb)) en un sistema HiSeq 4000 (Illumina); para los virus PR8 y Udorn, las bibliotecas se secuenciaron (1 × 150 pb) en un sistema NextSeq 500 (Illumina).

SPLASH

Las muestras de SPLASH se prepararon como se había publicado anteriormente24,35, con algunas modificaciones, para dos réplicas de cada uno de los virus WSN, PR8 y Udorn y una única réplica para cada uno de los virus reordenados H3N2. El virus purificado se incubó con 200 μM de EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) y 0,01% de digitonina (Merck) durante 5 minutos a 37 °C. El virus se extendió en una placa de 6 pocillos, se cubrió con una placa de vidrio, se colocó en hielo y se irradió durante 45 min utilizando una lámpara UV de mano de productos ultravioleta UVP (Thermo Fisher Scientific). El virus reticulado se trató con proteinasa K y se extrajo el ARN viral con TRIzol (Invitrogen). Se utilizó una alícuota del ARN viral extraído para detectar la incorporación de biotina utilizando un kit de módulo de detección de ácido nucleico quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) en una membrana de nylon Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). El resto del ARN viral extraído se fragmentó utilizando el NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) y se seleccionó el tamaño de los fragmentos inferiores a 200 nt utilizando el RNA Clean & Concentrator-5 Kit. Las muestras se enriquecieron para el ARN viral biotinilado utilizando las perlas Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific); la ligadura de proximidad en la perla y la inversión del enlace cruzado con psoraleno se llevaron a cabo como se ha publicado anteriormente24,35. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el kit comercial SMARTer smRNA-Seq (Clontech Laboratories). La selección del tamaño final se realizó corriendo las bibliotecas de secuenciación amplificadas por PCR en un gel PAGE al 6% (Thermo Fisher Scientific) en Tris/ácido bórico/EDTA (TBE), seleccionando el ADN de 200-300 pb. Las bibliotecas se secuenciaron 1 × 150 pb en un sistema NextSeq 500.

Procesamiento de las lecturas de secuenciación SHAPE-MaP

Las lecturas de secuenciación se recortaron para eliminar los adaptadores utilizando Skewer v0.2.2 (ref. 36). Los perfiles de reactividad de SHAPE-MaP se generaron utilizando el pipeline ShapeMapper2 publicado37, que alinea las lecturas con el genoma de referencia y calcula las tasas de mutación en cada posición de nucleótido. Las tasas de mutación se convierten entonces en los valores de reactividad SHAPE-MaP definidos como:

donde mutr1M7 es la tasa de mutación de nucleótidos en la muestra tratada con 1M7 y mutrDMSO es la tasa de mutación en la muestra tratada con DMSO. Todas las reactividades SHAPE-MaP se normalizaron a una escala aproximada de 0-2 dividiendo los valores de reactividad SHAPE-MaP por la reactividad media del 10% de los nucleótidos más reactivos tras excluir los valores atípicos (definidos como nucleótidos con valores de reactividad que son >1,5 el rango intercuartil). Las reactividades altas de SHAPE-MaP indican regiones de ARN más flexibles (es decir, de una sola hebra) y las reactividades bajas de SHAPE-MaP indican regiones de ARN más restringidas estructuralmente (es decir, emparejadas por bases).

Procesamiento de lecturas de secuenciación SPLASH

Las lecturas de secuenciación se recortaron para eliminar los adaptadores utilizando Skewer v0.2.2 (ref. 36). Se utilizó STAR v.2.5.3 (ref. 38) para alinear las lecturas con el genoma de referencia del virus correspondiente (Tabla suplementaria 2). Sólo las lecturas quiméricas en las que al menos 20 nt se alinearon con los segmentos de referencia se utilizaron en el procesamiento posterior (parámetro de STAR: -chimSegmentMin 20). Las lecturas quiméricas se deduplicaron utilizando cadenas CIGAR y posiciones de alineación. Las cadenas CIGAR de cada alineación de lectura se procesaron para encontrar las coordenadas de inicio y final de la lectura. Las coordenadas de las lecturas quiméricas se utilizaron para producir una matriz de interacciones de secuencias en el software R. Se seleccionaron loci discretos en la matriz y se ajustaron individualmente con una curva gaussiana basada en la intensidad de solapamiento de las lecturas para definir una ventana de interacción; las ventanas de interacción de loci complejos solapados se separaron en ventanas individuales. La anchura de la ventana de interacción se utilizó para determinar las coordenadas de inicio y fin de cada interacción; el número de lecturas que estaban dentro (o parcialmente dentro) de esta región se utilizó como medida de la frecuencia de interacción. Para la generación de figuras, se visualizaron las 20 principales interacciones en cada virus utilizando el paquete circlize v.0.4.5 (ref. 39) en R v.3.5.1. El conjunto completo de loci de interacción se proporciona en la Tabla Suplementaria 2. Para la validación por qPCR de los loci de interacción, se prepararon y enriquecieron muestras reticuladas con psoraleno como se ha descrito anteriormente, pero con un tiempo de fragmentación más corto (3 frente a 4 min) para generar fragmentos de ARN más largos. El ARN se poliadeniló con poli(A) polimerasa (Takara Bio) y se generó ADN complementario utilizando el cebador smRNA dT (Takara Bio) y la transcriptasa inversa PrimeScript (Takara Bio) según las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo una qPCR de 50 ciclos según las instrucciones del fabricante en un instrumento StepOnePlus (Applied Biosystems) utilizando la Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix con ROX (Agilent Technologies) y pares de cebadores para comprobar las interacciones entre segmentos. Las secuencias de los cebadores se indican en la Tabla Suplementaria 3. Tras 50 ciclos de amplificación de la qPCR, los productos se resolvieron mediante PAGE al 8% (acrilamida/bis-acrilamida 29:1, tampón TBE 1×) y se visualizaron con transiluminación de luz azul.

Predicciones de la estructura del ARN

El algoritmo IntaRNA v.2.3.1 (ref. 40) se utilizó para predecir la capacidad de las interacciones ARN-ARN para ocurrir en las regiones identificadas durante el análisis SPLASH, utilizando el modo exacto (-modo E) y sin restricción de semilla (-noSeed) opciones. Las reactividades SHAPE-MaP se incluyeron en la modelización de las interacciones ARN-ARN (-tShape y -qShape). Se generaron conjuntos de datos permutados barajando aleatoriamente los socios de interacción específicos identificados por SPLASH y evaluando las energías de interacción ΔG mediante IntaRNA. La importancia de la diferencia entre las distribuciones de probabilidad de las energías ΔG asociadas a las interacciones intermoleculares de ARN identificadas por SPLASH frente a los conjuntos de datos permutados se calculó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon en el software R. Las predicciones de la estructura del IntaRNA se utilizaron entonces para recortar las regiones de interacción a los nucleótidos implicados en el emparejamiento de bases. En los casos en los que no se disponía de datos SHAPE-MaP (reordenamientos PR8 con virus H3N2), se desactivó el prepliegue de cada cadena de ARN («accesibilidad») en IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Para la validación frente a estructuras conocidas, se extrajeron datos de estructuras secundarias de ARN de la base de datos RNA3Dhub41 , basados en las estructuras de microscopía electrónica criogénica del ribosoma 80S42 (PDB: 6EK0) y del complejo spliceosomal de triple ribonucleoproteína nuclear U4/U6.U543 (EMDB: EMD-2966). Las secuencias de ARN de referencia se corrigieron para que coincidieran con las secuencias bovinas (MDBK) para el ARN ribosómico y los ARN nucleares pequeños U4/U6, tal como se ha descrito anteriormente44. Para las predicciones de la estructura intramolecular del ARN, se utilizó el paquete ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). Se utilizó el comando RNAfold para predecir las estructuras secundarias de ARN y las funciones de partición para cada segmento. Las reactividades SHAPE-MaP se incluyeron como restricciones pseudoenergéticas. Se utilizó un análisis de correlación de ventana mediana deslizante de 50 nt entre los perfiles de reactividad SHAPE-MaP ex virio e in virio para determinar el grado de correlación SHAPE-MaP entre el ARN transcrito por T7 y el asociado a vRNP. Encontramos que no existía ninguna correlación >150 nt; por lo tanto, establecimos la restricción de distancia de emparejamiento máxima para las predicciones de estructura y función de partición a 150 nt. Para las predicciones de la estructura intramolecular, establecimos que los nucleótidos dentro de la región promotora fueran de una sola hebra.

Cultivo de células para la ingeniería inversa de los virus de la gripe

Las células MDCK y las células de riñón embrionario humano (HEK 293T) se obtuvieron de una colección existente en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Melbourne. Las células MDCK se cultivaron en el medio RPMI 1640 del Roswell Park Memorial Institute (Sigma-Aldrich) y las células HEK 293T se cultivaron en DMEM (Thermo Fisher Scientific). Ambos medios se complementaron con un 10% de FCS inactivado por calor, 2 mM de l-glutamina, 2 mM de piruvato sódico, 24 μg ml-1 de gentamicina, 50 μg ml-1 de estreptomicina y 50 IU ml-1 de penicilina. Los cocultivos de células MDCK y células HEK 293T para la transfección se establecieron en Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) con 50 μg ml-1 de estreptomicina y 50 IU ml-1 de penicilina.

Construcción de virus de la gripe de ingeniería inversa

Segmentos genéticos individuales de los virus PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) y Wyo03 (H3N2) se transcribieron inversamente y se clonaron en plásmidos pHW200046. Los virus derivados de la genética inversa contenían un gen PR8, Udorn, Mem71, PC73 o Wyo03 PB1 con un gen NA de tipo salvaje o modificado en un fondo genético que comprendía seis segmentos del virus PR8 (PB2, PA, HA, NP, M y NS). El gen NA modificado (Wyo03UdSub) se derivó de Wyo03 y llevaba 4 sustituciones hacia la secuencia Udorn-NA: los nucleótidos G943A; C938U; U933C; y G923A. Tres de estos cuatro cambios de nucleótidos eran silenciosos, y el cuarto (A534G) daba lugar a un cambio conservador de lisina a arginina (K172R). Se generaron fragmentos complementarios que incorporaban estos cambios mediante PCR y se unieron mediante otra ronda de PCR utilizando cebadores específicos del segmento que contenían sitios de restricción BsmBI47; el producto se clonó en el vector de expresión pHW2000 para el rescate del virus. Las secuencias de los cebadores se indican en la Tabla Suplementaria 3. Los virus rescatados se amplificaron en huevos de gallina embrionados de 10 días. El líquido alantoideo infeccioso se valoró para el contenido de virus mediante la formación de placas en células MDCK48 y se almacenó a -80 °C.

Determinación de la cinética de replicación viral de los virus de ingeniería inversa

Las características de replicación de los virus de ingeniería inversa se determinaron infectando células MDCK a una MOI de 0,01. Tras 1 h de absorción (a t = 0 h) se retiró el inóculo y las células se lavaron y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 en RPMI 1640 suplementado con 2 mM de l-glutamina, 2 mM de piruvato sódico, 24 μg ml-1 de gentamicina, 50 μg ml-1 de estreptomicina, 50 IU ml-1 de penicilina y 1 μg ml-1 de tripsina tratada con TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron en varios momentos tras la infección y se almacenaron a -80 °C para su análisis. Los títulos virales se determinaron mediante la formación de placas en monocapas confluentes de células MDCK.

La ingeniería inversa competitiva de nueve plásmidos de los virus de la gripe

La ingeniería inversa competitiva de los virus de la gripe se llevó a cabo utilizando una versión modificada del sistema de genética inversa de ocho plásmidos26 como se ha descrito anteriormente25. En resumen, los plásmidos que codifican los segmentos de ARN viral PB2, PB1, PA, hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), proteína de la matriz (M) y proteína no estructural (NS) de la PR8 se cotransfectaron con plásmidos que codifican el ARN viral de la neuraminidasa (NA) y el ARN viral PB1 competidor de Udorn, Mem71, PC73 o Wyo03 de tipo salvaje o modificado. Cada plásmido (1 µg) se mezcló con el reactivo de transfección FuGENE 6 (Promega) en Opti-MEM y se añadió a un cocultivo de células HEK 293T y MDCK. Seis horas después de la transfección, el medio se sustituyó por Opti-MEM suplementado con 50 μg ml-1 de estreptomicina y 50 IU ml-1 de penicilina. Veinticuatro horas después, se añadió tripsina tratada con TPCK (1 μg ml-1) y se recogió el sobrenadante después de otras 42 horas y se almacenó a -80 °C. Para determinar las frecuencias de incorporación de los genes PB1 competidores, los virus progenitores en el sobrenadante de transfección se sometieron a un ensayo de placas en células MDCK. Se recogieron placas elegidas al azar (aproximadamente 36 por experimento) por muestreo a través de la agarosa y se resuspendieron en Tritón-X100 al 0,05%. La fuente de los segmentos de genes competidores se identificó mediante RT-PCR cuantitativa específica de genes utilizando el kit de RT-PCR de un paso SensiFast probe no-ROX (Bioline). Cada reacción de 20 μl se llevó a cabo utilizando 5 μl de suspensión de virus recogidos en placa, 10 μl de mezcla 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step, 0,2 μl de transcriptasa inversa, 0,4 μl de inhibidor de RNasa Ribosafe, 0,8 μl de cada cebador directo y reverso específico de gen de 10 μM y 0,08 μl de cada sonda específica de gen de 25 μM. Las secuencias de los cebadores y las sondas se indican en la Tabla Suplementaria 3. La reacción de RT-PCR se incubó durante 10 min a 45 °C, antes de proceder a la amplificación por qPCR, según las instrucciones del fabricante. Los valores reportados son datos combinados de 3-8 experimentos de transfección independientes para cada competencia.

Resumen del informe

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.