Resumen
En el presente trabajo se presenta una descripción detallada de la ultraestructura de las células secretoras de los islotes pancreáticos del bagre sudamericano Rhamdia quelen. Se ofrecen pruebas que apoyan la afirmación de que los gránulos α consisten en una porción central y otra exterior de diferentes densidades y solubilidades electrónicas, que las células δ son muy probablemente células α morfológicamente alteradas pero viables, y que los gránulos β poseen posiblemente una subestructura repetitiva y pueden por tanto representar una forma de almacenamiento cristalino intracelular de la insulina.
1. Introducción
Los islotes de Langerhans fueron descubiertos en el conejo por Langerhans en 1869. Sin embargo, fueron descritos por Stannius y Blockmann en teleósteos unos 20 años antes y, por tanto, también se denominan, aunque con menor frecuencia, cuerpos de Stannius o de Blockmann. Los islotes de Langerhans son de origen endodérmico y en la mayoría de los teleósteos se encuentran como pequeños cuerpos dispersos en la porción exocrina del páncreas.
El pez no tiene un páncreas discreto. El tejido pancreático exocrino puede encontrarse disperso a lo largo del tracto intestinal. La estructura acinar del páncreas exocrino es muy similar a la de los mamíferos y comprende células con un citoplasma muy oscuro y basófilo . En los peces que se alimentan activamente, contienen un gran número de gránulos secretores eosinófilos brillantes. Se ha podido distinguir el islote pancreático endocrino de Langerhans, cuyo tejido comprende células α (que producen péptido similar al glucagón), células β (que producen insulina) y células d (que producen somatostatina) . En los mamíferos y en los seres humanos, la mayoría de las descripciones microscópicas electrónicas anteriores de los islotes pancreáticos humanos adultos han sido breves y pequeñas partes de las publicaciones se dedican principalmente a descripciones de tumores de células β o a artículos de estudio que discuten la morfología comparativa de los islotes de varias especies.
El páncreas de los peces no suele ser una fuente fácil de tejido para el estudio microscópico electrónico. El páncreas principal de los peces es similar tanto anatómica como evolutivamente al páncreas de los mamíferos, mientras que en otras especies de peces se aprecian diferencias importantes. En el pez cebra adulto, el páncreas principal contiene varios islotes principales rodeados de tejido exocrino. Una cola de islotes individuales incrustados en tejido exocrino y grasa se extiende caudalmente a lo largo del intestino. En cambio, las células β de la tilapia (otro pez teleósteo sensible a la glucosa) residen en islotes de Langerhans situados a lo largo del mesenterio que no están rodeados de tejido exocrino . Rhamdia quelen es una especie teleósteo y es una especie importante para la acuicultura en climas subtropicales. R. quelen se encuentra desde el sur de México hasta el centro de Argentina, y la cría de esta especie se está extendiendo hacia el sur de Brasil .
En el presente estudio analizamos la ultraestructura de los islotes de Langerhans y describimos en detalle los diferentes tipos de células secretoras en el bagre sudamericano R. quelen.
2. Materiales y Métodos
Cuatro R. quelem de cultivo dos hembras y dos machos ( g; cm) procedentes del Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) de la región noreste de Argentina y repoblados en tanques de 200 L donde fueron aclimatados durante dos semanas antes de la necropsia. Los peces fueron criados con agua dulce filtrada y mantenida a 25°C con una tasa de cambio de agua del 100% por día. El fotoperiodo se ajustó a 12 h de oscuridad y 12 h de luz. Fueron alimentados a mano cuatro veces al día con una dieta comercial (Ganave). Se practicó la eutanasia a los peces con benzocaína (500 ppm) y se les practicó la necropsia y se fijaron muestras de la grasa que se extiende caudalmente a lo largo del intestino en formalina tamponada al 10%, se incrustaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).
Se cortaron pequeños fragmentos de tejido en bloques de 1 mm y se fijaron inmediatamente en glutaraldehído tamponado con fosfato (pH 6.9 a 4°C), se lavaron en solución de Millonig y se posfijaron en tetróxido de osmio al 1%; a continuación, los bloques de tejido se deshidrataron en una serie graduada de etanol-acetona, se sumergieron en óxido de propileno y se incrustaron en Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Suiza). Se cortaron secciones finas con un ultramicrotomo LKB y se tiñeron dos veces con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de examinarlas en un microscopio electrónico Jeol JEM-8T (Jeol, Tokio, Japón).
3. Resultados
3.1. Microscopía de luz
R. quelen tiene el páncreas disperso por el tejido adiposo que rodea el conducto biliar común; éste se encuentra dentro de una región aproximadamente triangular delimitada superiormente por el estómago, anteriormente por el hígado e inferiormente por el bazo y la vesícula biliar. Cada islote de Langerhans se compone de tejido de islote relativamente puro rodeado de páncreas exocrino (Figura 1). No se observaron diferencias entre hombres y mujeres.
3.2. Microscopía electrónica
Las células β, que suelen ocupar el interior de los islotes, estaban comúnmente, pero no siempre, separadas del páncreas exocrino por las células α situadas periféricamente (Figura 2). El aspecto ultraestructural de las células β era idéntico en las muestras obtenidas de los cuatro peces. Los distintivos gránulos β estaban contenidos en sacos de membrana lisa y eran de tamaño y forma variables. Se observaron cristales rectangulares, cuadrados, hexagonales e irregularmente poligonales. Las formas redondas estaban presentes pero con menor frecuencia (Figuras 2 a 5). Cada gránulo constaba de una o varias formas cristalinas o no estructuradas de tamaño y forma variables. La elección del fijador no parecía influir en la estructura interna de los gránulos β. Dentro de los confines de la membrana envolvente, la zona periférica a los cristales aparecía vacía o contenía un fino precipitado floculento, independientemente del fijador utilizado. A mayores aumentos, a veces era visible una subestructura repetitiva en aquellos cristales correctamente orientados con respecto al plano de sección (Figuras 6 y 7). Las numerosas mitocondrias estaban dispersas por toda la célula y aparecían como estructuras filamentosas redondeadas o regordetas. Eran más grandes y numerosas que las de la célula β, pero generalmente más pequeñas que las de las células acinares pancreáticas. Las numerosas cristas mitocondriales estaban, en su mayoría, orientadas transversalmente, y los gránulos mitocondriales estaban presentes pero no eran prominentes. Las cisternas del retículo endoplásmico granular solían ser cortas o vesiculares (figuras 2 a 4). El retículo endoplásmico granular y los ribosomas libres no eran una característica tan prominente de las células β como en las células acinares o β. Aquellas células β con pocos gránulos de secreción normalmente estaban más ricamente dotadas de ribosomas y retículo endoplásmico granular, cuya configuración era entonces más frecuentemente cisternal (Figura 5).
El complejo de Golgi era más prominente tras la fijación con aldehídos y las estructuras que lo componen estaban más dilatadas (Figura 2). Después de utilizar estos fijadores, ocasionalmente era visible material amorfo denso dentro de las vesículas de Golgi y puede representar gránulos inmaduros o precursores de los gránulos β-secretores. Los núcleos de las células β solían ser esféricos y de contorno relativamente suave. La membrana celular de las células de los islotes adyacentes estaba en estrecha aposición con los desmosomas, aunque no frecuentemente unida a ellos. En la unión de tres o más células, las membranas limitantes eran a menudo convulsas, con interdigitaciones tortuosas de las células (Figuras 2 y 9). Las inclusiones citoplasmáticas multivesiculares que se asemejan al ceroide eran conspicuas en la mayoría de las células β (Figuras 2, 7, 9 y 8). La aparición y la frecuencia de estas inclusiones no se vieron afectadas de forma apreciable por el uso primario de ácido ósmico o aldehído como fijador, y no hubo ninguna relación aparente entre la presencia de estos gránulos y la evidencia morfológica de la actividad fisiológica de las células. La ultraestructura de las células α era la misma en las cuatro muestras de tejido. El tamaño y la forma de estas células y de sus núcleos no eran significativamente diferentes de los de las células β normales (Figuras 2 y 7). Aunque ocasionalmente se encontraba una célula α con un núcleo de forma irregular o indentado, esto no ocurría con suficiente frecuencia como para servir de criterio diferenciador útil. Los gránulos citoplásmicos de las células α se conservaron mediante la fijación primaria con osmio como cuerpos densos y esféricos de tamaño variable, y estaban contenidos en sacos de membrana lisa que se ajustaban sin problemas (figuras 7 y 9). Eran más grandes que los gránulos β, pero considerablemente más pequeños que los gránulos de zimógeno de las células acinares (Figura 2). Las mitocondrias, delgadas y alargadas, eran moderadas en número y más pequeñas que las de las células β y poseían cristas que solían estar orientadas transversalmente. El retículo endoplásmico granular era a menudo de configuración cisternal y más abundante que en las células β (Figura 9). El complejo de Golgi, cuando era visible, era de proporciones moderadas. Los materiales amorfos densos dentro de las vesículas y cisternas de Golgi, presumiblemente los precursores de los gránulos de secreción, eran más comunes en las células α que en las β (Figura 10). Los cuerpos ceroides, aunque frecuentemente visibles, eran menos numerosos que en las células β (Figuras 2 y 3). Los sacos en los que se sitúan los gránulos α parecían, por tanto, completamente llenos, y se concluyó que los gránulos están formados por un núcleo interno redondeado y denso y un manto externo menos denso en electrones que estaba ausente tras la fijación con osmio (Figuras 3 y 9) y, por tanto, quizá más soluble. No se observó ninguna subestructura consistente dentro de las porciones internas o periféricas de los α-gránulos. En ningún momento se observaron células que pudieran interpretarse como formas de transición entre las células α y las células β. Los gránulos α, incluyendo las porciones externas e internas más densas, eran comparables en tamaño total a los «gránulos δ». Además, hay células intermedias que contenían gránulos de ambos tipos, lo que sugiere que las células δ eran en realidad células α modificadas (Figura 10). Las células δ fueron visualizadas, aunque casi siempre localizadas entre las células α, y han sido identificadas y distinguidas ultraestructuralmente de las células α sobre la base de la menor densidad de electrones y el mayor tamaño global de sus gránulos secretores. Además, hay células intermedias que contenían gránulos de ambos tipos, lo que sugiere que las células δ eran en realidad células α modificadas (Figura 11).
Aunque existía una relación inversa entre el número de gránulos secretores y la prominencia del complejo de Golgi y del retículo endoplásmico granular, no se observó ningún patrón de liberación de gránulos α o β. Una fina membrana basal y cantidades variables de tejido conectivo solían separar los islotes pancreáticos de las células acinares adyacentes (Figura 2). En ocasiones, sin embargo, no había ninguna membrana basal entre los islotes y las células acinares, que estaban separadas únicamente por el estrecho espacio intersticial. Las células endoteliales capilares fenestradas estaban siempre separadas de ellas por, al menos, la membrana basal capilar (Figura 9). A veces también estaban presentes otros elementos de soporte, como componentes del colágeno y del tejido elástico. No se observaron diferencias entre machos y hembras.
4. Discusión
Las células β de los peces se distinguen fácilmente de las células α por la morfología de los gránulos secretores. La frecuente presencia de subunidades angulares y la aparente subestructura repetitiva sugieren una naturaleza cristalina para los gránulos β. Los intentos de resolver y medir las dimensiones de una red cristalina aún no han tenido éxito. Cuando se han visualizado los gránulos secretores en las inmediaciones del complejo de Golgi, no suelen observarse subunidades cristalinas. Es tentador especular, por tanto, que los gránulos no cristalinos o el material amorfo dentro del complejo de Golgi representan una forma química o física diferente de la insulina o del complejo proteico de la insulina que las subunidades cristalinas del gránulo. Se desconoce si estas diferentes formas morfológicas dentro de los gránulos β tienen diferentes solubilidades y quizás diferentes patrones orates de liberación en respuesta a la demanda fisiológica. No se observaron gránulos secretores en las cisternas o vesículas del retículo endoplásmico granular. Se supone que, al igual que en otras células secretoras de proteínas, el complejo de Golgi funciona para concentrar o «empaquetar» el producto sintetizado en el retículo endoplásmico granular. De ello se desprende lógicamente que los sacos de membrana lisa en los que se encuentran los gránulos secretores se derivan de las membranas de Golgi y no del retículo endoplásmico granular.
Las células α, con sus gránulos secretores grandes, redondeados y densos, son bastante similares a las células α de otras especies. Aunque los gránulos de las células α varían mucho en cuanto a sus dimensiones, la mayoría de las células parecen poseer una variedad de gránulos de diferentes tamaños, lo que excluye una subclasificación de este tipo de células como se ha sugerido para otras especies. Por el momento, no se han publicado datos fisiológicos que apoyen la existencia de la «célula δ» en el islote pancreático de los peces. Los diversos protagonistas han apoyado la existencia de las células δ con datos basados en exámenes microscópicos de plata caprichosa, ácido fosfotúngstico-hematoxilina y otras tinciones de gránulos o estudios microscópicos electrónicos de tejidos mal conservados. Las micrografías presentadas aquí apoyan la opinión considerada por Bloom en 1931 y posteriormente por Gomori en 1941 de que las células δ podrían representar células α modificadas.
La transición del típico gránulo α, con porciones internas densas y externas menos densas, a un gránulo δ de aproximadamente el mismo tamaño, con densidad uniforme pero disminuida, suele ir acompañada de una pérdida gradual de la integridad morfológica o de la intensidad de la tinción de las mitocondrias, el complejo de Golgi y los componentes membranosos del retículo endoplásmico granular. Los núcleos intactos y de apariencia viable, así como la persistencia de un pequeño número de ribosomas libres y cuerpos ceroides, sugieren que las denominadas células δ son viables incluso en la supuesta fase final de esta transición, es decir, cuando los propios gránulos secretores ya no son visibles y todos los orgánulos citoplasmáticos distintos de los gránulos ceroides y los ribosomas están ausentes. A falta de datos fisiológicos que asignen una función a las células δ y en ausencia de una evidencia morfológica más convincente para un tipo celular separado, se espera que la presentación aquí de una probable transición de las células α a las células δ sea aceptada como la explicación más probable de la tercera célula granular de Bloom en humanos. Se desconoce la importancia de estas células α viables pero alteradas. Aunque las células α y β, solas o en pequeños grupos, pueden verse dentro de los acinos y los conductos, en ninguna de las cuatro muestras pancreáticas estudiadas se observaron formas intermedias entre las células acinares y las de los islotes o las de los conductos y las de los islotes, como habían sugerido Nakamura y Yokote (4).
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
L. A. Romano recibió becas de investigación de productividad del Consejo Brasileño de Investigación, CNPq (Proceso nº PQ 301002/2012-6).