Introducción

La azida sódica (NaN3), como polvo blanco, incoloro y cristalino, está clasificada como una sustancia altamente tóxica. Sus efectos tóxicos son similares a los del cianuro, y daña los sistemas nervioso y cardiovascular, los ojos y la piel. Este elemento tóxico se activa rápidamente tras su ingestión, y sus principales efectos se producen varias horas después de la ingesta oral, dependiendo de la cantidad ingerida (1,2). La exposición al NaN3 puede inducir una serie de síntomas en cuestión de minutos, como náuseas, vómitos, dolor de cabeza, inquietud, mareos, debilidad, respiración rápida y latidos rápidos del corazón (3). Cantidades elevadas de este elemento tóxico inducen inmediatamente convulsiones, pérdida de conciencia, baja frecuencia cardíaca y presión sanguínea, y fallo respiratorio, lo que finalmente conduce a la mortalidad (3). Entre los mecanismos de acción demostrados del NaN3, el más relevante es la inhibición del complejo de la cadena respiratoria de la citocromo oxidasa (4). Estudios anteriores han revelado que el NaN3, un inhibidor del complejo IV (Cox IV), puede inducir la apoptosis en neuronas corticales primarias, que es dependiente de la caspasa-3 y está asociada a la liberación de citocromo c (5).

En la biosíntesis mitocondrial, el promotor de la cadena respiratoria Cox IV puede ser activado por los factores respiratorios nucleares (Nrf)-1/2. Concomitantemente, Nrf puede ajustarse regulando la actividad de los genes que codifican el factor de transcripción mitocondrial A(Tfam) para regular indirectamente los niveles de expresión de los genes de la cadena respiratoria. Nrf-1/2, Tfam, el coactivador 1-α del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (Pgc-1α) y otros coactivadores constituyen la cascada de señales Pgc-1α, que desempeña un papel central en una red reguladora que rige el control transcripcional de la biogénesis mitocondrial y la función respiratoria. En esta cascada de señales, Pgc-1α activa primero a Nrf-1/2 en lugar de unirse directamente al ADN mitocondrial, y Nrf-1/2 induce la activación de Tfam en combinación con el promotor de Tfam y desencadena la transcripción y replicación del ADN mitocondrial, dando lugar a un aumento de los niveles de expresión de las proteínas mitocondriales (6). Al mismo tiempo, la Pgc-1α puede ser activada por las vías de señalización mediadas por la CaN-, la proteinkinasa dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMK), la proteinkinasa activada por mitógenos (MAPK) y la quinasa dependiente de ciclina (7). En el presente estudio, se utilizaron células PC12 para generar un modelo de neurona dopaminérgica, y se investigaron los efectos y el mecanismo del NaN3 en las vías asociadas a Pgc-1α en las células PC12, para identificar si el NaN3 induce toxicidad en las células PC12 cultivadas y los mecanismos subyacentes implicados en estos efectos.

Materiales y métodos

Materiales

Las células PC12 de feocromocitoma de rata se adquirieron del Banco de Células de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Se disolvió una solución madre de NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) en una solución salina estéril para obtener una solución madre de 1 M, que se diluyó posteriormente a las concentraciones deseadas antes de la experimentación. Un kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un solo paso (C1090), un kit de detección de apoptosis con isotiocianato de fluoresceína (FITC) Annexin V (C1063), un kit de ensayo de adenosina 5′-trifosfato (ATP) mejorado (S0027), El kit de ensayo del potencial de la membrana mitocondrial JC-1 (C2006) y el kit de ensayo de las especies reactivas del oxígeno (S0033) fueron proporcionados por el Instituto de Biotecnología Beyotime (Haimen, China).

Cultivo celular y ensayo de viabilidad

Las célulasPC12 se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, EE.UU.) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, EE.UU.) y una solución antimicrobiana al 1% compuesta por 10.000 U de penicilina y 10.000 U de estreptomicina. Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada del 5% de CO2 y se utilizaron siempre con una confluencia del 70-80%.

La viabilidad de las células PC12 se determinó utilizando un kit de recuento de células (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, China). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1×105/pocillo. Tras 24 horas de cultivo, las células se trataron con NaN3 (0-80 mM) y se incubaron durante 12, 24, 48 y 72 horas para establecer el modelo de lesión celular. Posteriormente, se añadieron 10 µl de solución de CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas más en condiciones estándar (37°C y 5% de CO2). La absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se determinó con el ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). La viabilidad celular se calculó según la densidad óptica media de 6 pocillos. Los experimentos se realizaron por triplicado. Las concentraciones adecuadas de NaN3 para su uso en experimentos posteriores se determinaron de acuerdo con los resultados de los ensayos de viabilidad celular.

Morfología nuclear de las células PC12 teñidas con DAPI

Las células PC12 se expusieron a 0, 10, 20 y 40 mMNaN3 durante 24 h. Para distinguir la muerte celular programada de la no apoptótica, se tiñeron los núcleos con 10µg/ml de DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Brevemente, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de tres lavados, las células fijadas se tiñeron con DAPI (1:5.000) durante 5 minutos y se lavaron con PBS. Se adquirieron imágenes de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia Leica DMI (aumento, ×400).

Medición de la tasa de apoptosis

Se utilizó un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI (Beyotime Institute of Biotechnology) para determinar la apoptosis de las células según las instrucciones del fabricante: Las tasas de apoptosis de las células PC12 de control (0 mMNaN3) y de las células PC12 expuestas a 10, 20 y 40 mMNaN3 durante 24 horas se midieron por citometría de flujo (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Los análisis estadísticos se realizaron con el software estadístico SPSS v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.).

La medición del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

ΔΨm es un parámetro importante de la función mitocondrial. Se evaluó mediante tinción con JC-1, una sonda fluorescente. Los experimentos se repitieron por triplicado y se realizaron como sigue: Las células PC12 de control se trataron con 0 mM de NaN3; y las células PC12 experimentales se expusieron a 10, 20 y 40 mM de NaN3 durante 24 h. Posteriormente, según el protocolo del fabricante (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), las células se incubaron con el medio que contenía JC-1 (1X) a 37°C durante 20 min, las células se lavaron tres veces con tampón de lavado y se recogieron con medio fresco sin suero. Al mismo tiempo, el control positivo se trató con cianuro de carbonilo3-clorofenilhidrazona (CCCP), un inhibidor, (10 µM) a 37°C durante 20 minutos. A continuación, se determinó la fluorescencia roja/verde mediante FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Las proporciones de la intensidad de fluorescencia roja sobre la intensidad de fluorescencia verde representaron los niveles de ΔΨm.

Medición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Las ROS en las células PC12 se evaluaron utilizando un kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, China). La generación intracelular de ROS se evaluó mediante diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA), una sonda fluorescente. Las ERO intracelulares oxidan el DCFH-DA, produciendo el compuesto fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF), y la intensidad de la fluorescencia del DCF se considera paralela a la cantidad de ERO formadas, según las instrucciones del kit de ensayo de ERO.Los experimentos se repitieron por triplicado y se realizaron de la siguiente manera: el control positivo se trató con una concentración específica de Rosup (50 mg/ml); las células PC12 de control se trataron con 0 mMNaN3; y las células PC12 experimentales se expusieron a 10, 20 y 40 mM de NaN3 durante 24 h. Además, las células PC12 se trataron con DCFH-DA (10 mM) disuelto en DMEM sin suero (1:1.000) durante 20 min a 37°C y luego se lavaron tres veces con DMEM sin suero. El control positivo se trató con Rosup, para inducir la producción de ROS. La producción de ROS se determinó mediante FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Las intensidades medias de fluorescencia (MFI) representaron los niveles de ROS.

Medición del contenido de ATP celular en células PC12

Los experimentos se repitieron por triplicado y se realizaron de la siguiente manera: Las células PC12 de control se trataron con 0 mMNaN3; y las células PC12 experimentales se expusieron aNaN3 a diferentes concentraciones (10, 20 y 40 mM) durante24 h. Posteriormente, se determinó el contenido de ATP celular utilizando un kit de ensayo de ATP de luciferasa deFirefly (Beyotime Institute ofBiotechnology) según el protocolo del fabricante.

Análisis de Western blot

Las células PC12 se expusieron a 0, 10, 20 y 40 mMNaN3 durante 24 horas, se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Beyotime Institute of Biotechnology) que contenía un inhibidor de aproteasas y se centrifugaron a 13.362 × g durante 10 minutos a 4°C para recoger los sobrenadantes. Posteriormente, se determinaron las concentraciones de proteínas utilizando el kit BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Se sometieron cantidades iguales de proteínas (90 µg) a SDS-PAGE al 10 y al 12%, y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilo (0,45 µm) utilizando una unidad de electrotransferencia Semidry (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Tras el bloqueo con un 5% de albúmina de suero bovino en TBS que contenía un 0.1% de Tween-20 (TBST) durante 2 horas a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.; 1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam; 1:1.000), procaspasa-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurina A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1.000), CaMKII fosforilada (p)-(Cell Signaling Technology; 1:1.000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.1:1.000), p-extracelular signal-regulated kinase(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), proteína X asociada al linfoma de células B-2 (Bcl-2) (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc, Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) y citocromo c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) a 4°C durante la noche. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) (conejo; nº de cat. A0208;1:1.000; o ratón; nº de cat. A0216; 1:1.000; ambos del Instituto Beyotime de Biotecnología) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) y se analizaron cuantitativamente con Image J versión l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), y se seleccionó la β-actina como control de carga.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el software estadístico SPSS v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Los datos se expresan como media ± desviación estándar error de la media. La significación estadística de las diferencias entre grupos se determinó mediante un análisis de la varianza de una vía seguido de pruebas post-hoc de Bonferroni. Se consideró que P<0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa. Cada experimento se repitió al menos tres veces.

Resultados

El NaN3 inhibe el crecimiento de las células PC12

El efecto de la exposición al NaN3 sobre la proliferación de las células PC12 se evaluó mediante el ensayo de CCK-8. Las células se sometieron a un tratamiento de exposición al NaN3. Las células se sometieron a diferentes concentraciones (0-80 mM) de NaN3 durante 12-72 h. La Tabla I y la Fig. 1A-D indican que la viabilidad de las células se vio reducida por el NaN3 de forma dependiente de la concentración. Casi el 100% de las células murieron tras la exposición a 80 mM de NaN3 durante 72 horas, lo que indica que el NaN3 indujo notablemente la muerte celular, y la citotoxicidad del NaN3 se detectó de forma dependiente de la dosis y el tiempo. La exposición al NaN3 a una concentración de 20 mM durante 24 horas provocó una marcada muerte celular en las célulasPC12 (50%). Por lo tanto, las células cultivadas durante 24 h se utilizaron para los experimentos posteriores.

Morfología celular

En la tinción con DAPI, se observaron los cambios morfológicos de las células PC12 mediante microscopía de fluorescencia tras la exposición a diferentes concentraciones de NaN3. Se observó la fragmentación de los núcleos celulares expuestos al NaN3 durante 24 h, y la contracción de los núcleos celulares y la condensación de la cromatina aumentaron ligeramente con la concentración de NaN3 en las células PC12 en comparación con el control. En estas células, las células apoptóticas eran más pequeñas y brillantes en comparación con las células normales. Además, el número de células apoptóticas y la intensidad de la fluorescencia verde aumentaron en las células expuestas al NaN3 (Fig. 2).

Determinación de la tasa de apoptosis mediante la tinción con anexina V-FITC

Las células muertas o apoptóticas tardías que han perdido la integridad de la membrana celular pueden teñirse con yoduro de propidio. Debido a la pérdida de la integridad de la membrana celular, la Annexin V-FITC puede entrar en el citoplasma y combinarse con la fosfatidilserina del interior de la membrana celular, mostrando fluorescencia verde en las células muertas. La Fig. 3 demuestra que el número de células apoptóticas fue de 5,03, 8,02, 43,77 y 78,67% (P<0,05) en las células PC12 tras la exposición al NaN3 en diferentes concentraciones (0, 10, 20 y 40 mM) durante 24 horas, respectivamente. Estos resultados confirmaron además que el NaN3 indujo la apoptosis celular de forma dependiente de la dosis.

Cambios en el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm)

Las mitocondrias se consideran generalmente orgánulos reguladores clave implicados en la viabilidad celular. Por lo tanto, se utilizó ΔΨm como indicador de la función mitocondrial. Las células PC12 se tiñeron con JC-1, un colorante catiónico que presenta una acumulación dependiente del potencial en las mitocondrias. La fluorescencia roja (agregados J), que representa a las mitocondrias activas con un potencial de membrana estable, se observó en un pequeño número de células expuestas a concentraciones crecientes de NaN3. Por el contrario, la fluorescencia verde (monómero J), que representa a las mitocondrias apoptóticas con ΔΨm dañado, se observó en un número de células. La proporción de fluorescencia roja y verde disminuyó gradualmente en el grupo de control (Fig. 4).

Acumulación de ROS mitocondriales inducida por NaN3

Es bien sabido que las mitocondrias son la principal fuente de ROS celular, y que las ROS desempeñan un papel importante en la desactivación de la señalización apoptótica. Por lo tanto, se investigó adicionalmente el papel de las ROS en la muerte de las células PC12 inducida por NaN3. La Fig. 5 indica que las intensidades de fluorescencia en las células de control y en las expuestas al NaN3 a varias concentraciones (0, 10, 20 y 40 mM) durante 24 horas fueron de 3,65, 6,99, 18,63 y 39.35, respectivamente, lo que indica que la exposición al NaN3 aumentó significativamente la producción de ROS mitocondriales en comparación con el grupo de control (P<0,05). Estos resultados sugieren que la apoptosis inducida por el NaN3 mejoró la producción de ROS intracelular.

El NaN3 regula a la baja la producción de energía mitocondrial del ATP celular

Para evaluar el contenido de ATP en las células PC12 expuestas al NaN3, se determinó cuantitativamente la unidad de luminiscencia relativa (RLU) mediante un luminómetro. La Fig. 6 indica que el NaN3 inhibió la producción de ATP mitocondrial y disminuyó gradualmente el nivel de ATP celular (P<0,05).

Niveles de expresión de Pgc-1α y proteínas asociadas a la apoptosis en las células PC12

La expresión de Pgc-1α a nivel proteico disminuyó significativamente tras la exposición al NaN3 en comparación con el control (P<0,05). Además, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 y Cox IV son objetivos bien conocidos de la dinámica de Pgc-1α en varios tipos de células (8). El presente estudio identificó que la exposición a NaN3 inhibió significativamente la dinámica de Pgc-1α de manera dependiente de la dosis (P<0,01; Fig. 7A).

Además, la exposición a NaN3 aumentó los niveles de expresión de Bax y del citocromo c, mientras que redujo los niveles de expresión de Bcl-2 y de procaspasa-3 (P<0,05). La relación Bax/Bcl-2 también aumentó significativamente en comparación con el grupo de control (P<0,05; Fig. 7B).

También se evaluaron los niveles de expresión proteica de otros miembros importantes, como CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK y p-p38 MAPK. Los resultados indicaron que el NaN3 aumentó la expresión de CaN y la fosforilación de CaMKII y p38 MAPK en comparación con el grupo de control, mientras que los niveles de expresión de CaMKII total y p38 MAPK no cambiaron. Además, las proporciones de p-CaMKII/CaMKII y p-p38/p38 MAPK en el grupo de NaN3 aumentaron significativamente en comparación con las del grupo de control (P<0,01; Fig. 7C).

Discusión

Para determinar si el NaN3 inhibía la proliferación de las células PC12, se comparó el número de células tratadas en la fase logarítmica con el número de células de control no tratadas. El crecimiento celular se inhibió en un ~75% tras 24 horas de exposición a 20 mM de NaN3. Por lo tanto, se utilizó esta concentración para los experimentos posteriores. La apoptosis conlleva cambios en la morfología celular, incluyendo el sangrado de la membrana, la contracción celular, la condensación de la cromatina, la fragmentación nuclear y la fragmentación del ADN (9). Para analizar adicionalmente la morfología nuclear de la apoptosis y la tasa de apoptosis, las células fueron tratadas con 0, 10, 20 y 40 mM de NaN3 durante 24 h. Tras el tratamiento, las células se tiñeron con DAPI y AnnexinV-FITC/PI, y se analizó la distribución de los núcleos. Los resultados confirmaron que la exposición al NaN3 indujo la apoptosis en las células PC12 de forma dependiente de la concentración.

Las mitocondrias están implicadas en numerosas funciones metabólicas, incluyendo el mantenimiento del pH intracelular y la producción de ROS, que promueven y regulan la apoptosis celular (10). Los rasgos distintivos de la apoptosis celular van precedidos de alteraciones mitocondriales, como la pérdida de ΔΨm, la disminución de la producción de energía (ATP) y el aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. Estudios anteriores han sugerido que las ROS provocan daños en la cadena respiratoria mitocondrial e inducen la pérdida de ΔΨm, que son los factores que median o amplifican la disfunción neuronal durante el curso de la neurodegeneración, lo que conduce al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas (11,12).Se sabe que el NaN3 impulsa la degeneración y la excitotoxicidad mediante el aumento del potencial de permeabilidad de la membrana mitocondrial a través de la peroxidación lipídica (13-15), y que el NaN3 ejerce su principal acción tóxica al inhibir la función de la citocromo oxidasa en la cadena de transporte de electrones mitocondrial e impedir la producción de ATP (4). En el presente estudio, se utilizó el FCM para identificar el ΔΨm y la producción de ROS en las células PC12. Además, se examinó la síntesis de ATP en las mitocondrias tras la exposición a diversas concentraciones de NaN3. La alteración de la membrana plasmática, el aumento de la producción de ROS mitocondriales y la disminución del contenido de ATP celular observados sugieren que la exposición al NaN3 induce la apoptosis en las células PC12.

La muerte celular mitocondrial puede ser activada por múltiples estímulos, incluyendo el programa de desarrollo, el daño del ADN, el estrés del retículo endoplásmico, la privación de factores de crecimiento y nutrientes, la infección viral y el estrés oxidativo (16). Como miembro de la creciente familia de correguladores nucleares, Pgc-1α puede activar un amplio conjunto de genes y regular los niveles de expresión de los genes implicados en el metabolismo energético en respuesta a las vías de señalización que median la termogénesis, la gluconeogénesis, el cambio de tipo de fibra muscular y la biogénesis mitocondrial (17).Estos correguladores existen y funcionan en grandes complejos multiproteicos, en los que, en lugar de unirse al ADN, regulan el Nrf-1/2 y la Tfam y modulan su potencia transcripcional promoviendo las subsiguientes interacciones bioquímicas necesarias para la inducción o represión de la transcripción génica (8). Además, Nrf-1/2 también controla indirectamente la expresión de los genes codificados por el ADN mitocondrial al inducir potentemente las Tfam A, B1 y B2 codificadas por el núcleo (Tfam,Tfb1m y Tfb2m, respectivamente), que son los reguladores de la transcripción y replicación del genoma mitocondrial (18). Estudios anteriores han demostrado que el NaN3 es un inhibidor del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial, que se ve afectado con frecuencia en los trastornos mitocondriales primarios (19,20).En el presente estudio, se examinó por primera vez en las células PC12 la expresión de la cascada de señales Pgc-1α, incluidas las proteínas de la familia Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 y Tfam) y Cox IV, para verificar si los eventos de señalización estaban implicados en la apoptosis inducida por el NaN3. Los resultados sugirieron que la apoptosis inducida por el NaN3 estaba asociada a los niveles de expresión de las proteínas de la familia Pgc-1α y Cox IV en la vía de señalización mediada por las mitocondrias. Cuando se aumentaron las concentraciones de NaN3, los niveles de expresión de estas proteínas se redujeron significativamente, lo que indica que pueden estar implicadas en la activación y el desarrollo de la apoptosis.

A la inversa, el complejo IV puede desencadenar la apoptosis en las neuronas corticales primarias, que es dependiente de la caspasa3 y se asocia con la liberación de citocromo c (5). Es bien sabido que las mitocondrias son reguladores clave de la apoptosis celular. Las proteínas de la familia Bcl-2 son los iniciadores importantes de la vía apoptótica mitocondrial. Esta familia incluye las proteínas pro-apoptóticas Bax, Bcl-2 homóloga antagonista/asesina y Bcl-2 asociada a la muerte celular y las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-extra grande (Bcl-xL). En las células sanas, Bax es una proteína citosólica inactiva, pero se traslada a las mitocondrias durante la apoptosis. Ejerce sus efectos proapoptóticos formando un poro en la membrana externa mitocondrial, a través del cual se libera citocromo c al citoplasma, lo que conduce a la activación de la caspasa 3 (21). Las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL suprimen la función de Bax manteniendo la integridad de la membrana mitocondrial, lo que impide la liberación del citocromo c y la activación de la caspasa 3 (22). En el presente estudio, el NaN3 aumentó los niveles del pro-apoptótico Bax y del citocromo c y disminuyó los niveles del anti-apoptótico Bcl-2 y de la procaspasa-3, lo que indica que el NaN3 inició la señalización de la apoptosis mitocondrial en las células PC12.

Además, los niveles de expresión de los coactivadores Pgc-1α son altamente inducibles a nivel transcripcional a través de una variedad de vías de señalización ascendentes. Por ejemplo, la expresión de Pgc-1α es inducida por el ejercicio y la exposición al frío bajo el control de la señalización del estrés a través del Ca2+ celular y la señalización del adenosina 5′-monofosfato cíclico (23). La transcripción de Pgc-1α puede verse afectada por CaMK, calcineurina, receptor β-adrenérgico/cAMP y p38MAPK (24-26). Además, la p38 MAPK, perteneciente a la familia MAPK, desempeña una función fundamental en la proliferación, la diferenciación, la transformación y la apoptosis de las células, ya que la activación de la apoptosis puede inducir la Pgc-1α mediante su fosforilación directa (27). En el presente estudio, se examinaron los niveles de expresión de las proteínas de las vías de señalización del Ca2+ (pan-calcineurina A y p-CaMKII/CaMKII) y de la vía de la p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK y p-Erk1/2) para investigar los efectos del NaN3 sobre la homeostasis del Ca2+ intracelular y la p38 MAPK. Los datos indicaron que los niveles de proteína de pan-calcineurina A, y los ratios p-CaMKII/CaMKII y p-p38MAPK/p38 MAPK aumentaron y el nivel de p-Erk1/2 disminuyó en el grupo tratado con NaN3, lo que sugiere que el NaN3 desencadenó la apoptosis de las células PC12 de forma dependiente de la dosis, y que dicha activación se asoció con las vías de Ca2+ y p38 MAPK. En conjunto, estos resultados experimentales confirman que el NaN3 puede inducir la apoptosis de las células PC12 mediante la activación de las vías Ca2+ y p38 MAPK. Hasta donde sabemos, el presente estudio revela por primera vez que el NaN3 induce la apoptosis mediada por las mitocondrias en las células PC12 a través de las vías de señalización asociadas a Pgc-1α, incluyendo Ca2+/p-CaMKII y p38 MAPK.

En resumen, el presente estudio demuestra que el NaN3 puede inducir la apoptosis de las células PC12. Para dilucidar el mecanismo tóxico subyacente de la exposición al NaN3, se examinaron los niveles de expresión de una serie de proteínas proapoptóticas (Bax y citocromo c) y antiapoptóticas (Bcl-2, procaspasa-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII y Pgc-1α). Los resultados confirmaron que las proteínas pro-apoptóticas ejercieron efectos pro-apoptóticos en las células PC12 a través de la activación y fosforilación de CaMKII y p38 MAPK, lo que estimuló la activación de Pgc-1α y procaspasa-3 en las células PC12. Los datos proporcionan una base para estudios posteriores que investiguen los mecanismos de acción del NaN3 a nivel molecular. Los estudios futuros pueden incluir la adición de agentes protectores, por ejemplo el inhibidor de la división mitocondrial 1, un derivado de la quinazolinona que es un inhibidor de la división mitocondrial recientemente identificado, antes del tratamiento con NaN3, para investigar los efectos neuroprotectores del agente protector en la atenuación de la apoptosis inducida por NaN3 en las células PC12, y para dilucidar adicionalmente el mecanismo subyacente.

Agradecimientos

No procede.

Financiación

El presente estudio ha sido financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención nº 81571848) y el Programa de Desarrollo Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos utilizados o analizados durante el presente estudio están disponibles a petición razonable del autor correspondiente.

Contribuciones de los autores

YZ y SZ concibieron y diseñaron el estudio. YZ, JH,HX, TG e YW adquirieron los datos. YZ, JH y HX analizaron e interpretaron los datos, y redactaron el manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito y leyeron y aprobaron la versión final del mismo.

Aprobación ética y consentimiento para participar

No procede.

Consentimiento del paciente para su publicación

No procede.

Intereses en competencia

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Glosario

Abreviaturas

Abreviaturas:

NaN3	azida de sodio
Cox IV	complejo IV
Tfam	factor de transcripción mitocondrialA
Nrf-1/2	factor respiratorio nuclear-1/2
CaN	pan-calcineurina A
Pgc-1α	coactivador del receptor γ activado por el proliferador de los péptidos 1-α
PC12	feocromocitoma de rata
ΔΨm	potencial de membrana mitocondrial
CCCP	cianuro de carbonilo3-clorofenilhidrazona
ROS	especies reactivas de oxígeno
FCM	citometría de flujo
MAPK	mitógeno-proteína quinasa activada

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