Aristoteles onderwees Alexander (356-323 v. Chr.) voordat de prins in 336 v. Chr. de troon van Macedonië erfde en begon met de uitbreiding van het rijk dat zijn vader door verovering had veroverd. Later kwamen er in de tuin van het Lyceum in Athene planten te staan die waren bijgedragen door volgelingen van Alexanders legers. Theophrastus baseerde veel van zijn plantbeschrijvingen op verslagen die hij had verkregen van reizigers die verre streken van Alexanders rijk hadden bezocht. De bibliotheek van Alexandrië, waar Dioscorides waarschijnlijk gebruik van maakte, werd geopend tijdens de regering van Alexanders generaal Ptolemaeus I Soter (ca. 367 v. Chr.-ca. 283 v. Chr.). Ptolemaeus I was een hechte persoonlijke vriend van Alexander en was mogelijk een medestudent die les kreeg van Aristoteles. Hij werd heerser over Egypte in 323 v. Chr. na de dood van Alexander. Het eigenlijke werk van het plannen van en toezicht houden op de bibliotheek werd gedelegeerd aan Demetrius van Phaleron (ca. 350-ca. 280 v. Chr.), een Lyceum student van Theophrastus.

Alexander regeerde vanaf 340 v. Chr. als regent over Macedonië, terwijl zijn vader, Philips II, een groot Macedonisch leger aanvoerde dat Thracië binnenviel, het land dat in het oosten aan Macedonië grensde. Later kreeg Alexander ruzie met Filippos en verliet hij Macedonië, maar in 336 v. Chr. werd Filippos vermoord en werd Alexander, 20 jaar oud, Alexander III van Macedonië, die later Alexander de Grote werd genoemd. Toen het nieuws van Filips’ dood zich verspreidde, zagen de mensen in de door de Macedoniërs veroverde landen een kans om hun vrijheid te grijpen, en Alexander moest wel handelen. Hij begon met het executeren van al zijn tegenstanders binnen Macedonië, en herstelde vervolgens de Macedonische heerschappij in Griekenland, Thracië en Illyrië.

Liet een ervaren generaal Antipater (ca. 398-319 v. Chr.) achter om de orde in eigen land te handhaven, in 334 v. Chr. leidde Alexander een grote troepenmacht naar Klein-Azië als de eerste fase van zijn keizerlijke expansie. De Macedoniërs versloegen een groot Perzisch leger, stelden de kust van Klein-Azië veilig, en bevochten en versloegen in 333 v. Chr. een ander Perzisch leger, ditmaal geleid door de Perzische koning Darius III. Alexanders troepen vochten zich vervolgens een weg naar het zuiden door Syrië en Phoenicië. In het voorjaar van 331 v. Chr. trokken de Macedoniërs Egypte binnen. Na enkele maanden keerden zij terug naar Tyrus, waar zij versterkingen uit Europa ontvingen en oostwaarts trokken. Zij versloegen de Perzen opnieuw bij Gaugemala, ten oosten van de rivier de Tigris, bezetten Babylon en veroverden vervolgens Susa en de Perzische hoofdstad Persepolis, waarna Alexander tot koning van Azië werd uitgeroepen. De Macedoniërs zetten daarna hun achtervolging op Darius voort, die zij stervend aantroffen aan wonden toegebracht door een van zijn eigen edelen – die later door de Macedoniërs gevangen werd genomen en op bevel van Alexander werd gestraft. Ze trokken oostwaarts naar Centraal-Azië en bereikten het Tian Shan-gebergte in West-China, waar een beeldje van een Griekse soldaat in een begraafplaats is gevonden.

In 326 v. Chr. nodigde Alexander de stamhoofden uit het huidige Noord-Pakistan uit om zich aan zijn heerschappij te onderwerpen. Sommigen stemden toe, maar anderen verzetten zich tegen de Macedoniërs en werden pas overwonnen na hevige gevechten waarbij Alexander gewond raakte. De Macedonische soldaten, die hun huis en familie weer wilden zien, verzetten zich tegen Alexanders plan om verder India in te trekken en haalden hem over om terug te keren. Zij bereikten Babylon, waar Alexander op 11 juni 323 v. Chr. stierf in het paleis van Nebukadrezzar II. Geschiedkundigen zijn niet zeker van de oorzaak van zijn dood, maar het is het meest waarschijnlijk dat het een ziekte was. Over nog een maand zou Alexander 33 jaar oud zijn geworden. Zoals de volgende kaart laat zien, strekte zijn rijk zich op zijn hoogtepunt uit van Macedonië in het westen tot de Indusvallei in het oosten, en van de zuidelijke kusten van de Zwarte Zee en de Kaspische Zee tot Egypte. Het rijk begon binnen enkele jaren na Alexanders dood uiteen te vallen in vele onafhankelijke koninkrijken.

Alexander was een leerling van Aristoteles geweest, en hoewel de opleiding van de jongeman onderbroken was, was hij zeer intelligent en had Aristoteles een sterke invloed op zijn ontwikkeling uitgeoefend. Aristoteles moedigde al zijn studenten aan om de natuurlijke wereld te observeren en te onderzoeken, en Alexander was zeer geïnteresseerd in planten en dieren. Een groot gevolg van geleerden vergezelde hem toen hij zijn legers aanvoerde. Zij maten afstanden, stelden kaarten op, bestudeerden onbekende godsdiensten, en ook de flora en fauna. Wanneer zij onbekende planten- of diersoorten tegenkwamen, stuurde Alexander specimens terug naar Europa, waarvan vele naar het Lyceum in Athene, ter attentie van Aristoteles zelf. Hij verzamelde zoveel mogelijk informatie over plaatselijke kruidenbehandelingen en beoefende de geneeskunde, waarbij hij persoonlijk een aantal van de verwondingen en ziekten behandelde waarmee zijn soldaten te kampen hadden.

In 332 v. Chr. stichtte Alexander de stad Alexandrië op de plaats van Rhakotis, een Egyptische vissershaven. Hij wilde met de stad een brug slaan tussen de culturen van Griekenland en Egypte, maar hij bleef er slechts een paar maanden nadat met de bouw was begonnen, en keerde nooit meer terug. Na Alexanders dood slaagde Ptolemaeus I erin zijn lichaam naar de stad te laten brengen. De bibliotheek van Alexandrië werd gebouwd als een replica van het Lyceum, met een zuilengalerij en tuinen. Er waren collegezalen, leeszalen en een gemeenschappelijke eetzaal, en de bibliotheek bevond zich naast en in dienst van het Musaeum, dat een tempel was die als academisch instituut werd gebruikt – de oorsprong van het woord museum. De beheerders van de bibliotheek kregen de opdracht alle informatie ter wereld te verzamelen. Vertegenwoordigers van de bibliotheek namen deel aan boekenbeurzen in Athene en Rhodos, en wanneer een schip in de haven aankwam werden alle boeken die het aan boord had in beslag genomen en gekopieerd, waarbij de bibliotheek de originelen behield en de kopieën aan de schipper teruggaf. Dit is de bibliotheek waar Pedanius Dioscorides wellicht gestudeerd heeft. Een groot deel van de bibliotheek werd in 48 v. Chr. tijdens een burgeroorlog per ongeluk in brand gestoken, en hoewel een filiaal van de bibliotheek, bekend als de dochterbibliotheek, ten zuiden van de stad bleef functioneren, werd ook deze in 391 v. Chr. verwoest toen de Romeinse keizer Theodosius I (347-395) de vernietiging van alle heidense tempels beval.