I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Enzymatische reactie (afbeelding opent in een nieuw venster)

Chymotrypsine is een serine endopeptidase dat wordt geproduceerd door de acinarcellen van de alvleesklier. Chymotrypsine wordt geactiveerd na proteolyse van chymotrypsinogeen door trypsine. Terwijl trypsine lysine en arginine hydrolyseert, splitst chymotrypsine selectief peptidebindingen gevormd door aromatische residuen (tyrosine, fenylalanine, en tryptofaan) (Hedstrom et al. 1992). Twee overheersende vormen van chymotrypsine, A en B, worden in gelijke hoeveelheden aangetroffen in de alvleesklier van runderen. Het zijn zeer vergelijkbare eiwitten (80% identiek), maar ze hebben significant verschillende proteolytische eigenschappen (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, en Gráf et al. 2004). De onderstaande informatie heeft vooral betrekking op de A-vorm van chymotrypsinogeen en chymotrypsine.

Geschiedenis:

In het begin van 1900 stelde Vernon voor dat uit pancreaspreparaten een intrinsieke activator van zijn eigen enzymen zou kunnen ontstaan (Vernon 1901). Vernon’s melkstollingsexperimenten stelden vast dat er ten minste twee enzymen aanwezig waren en dat de ene stabieler was dan de andere (Vernon 1902). Dit idee werd echter niet algemeen aanvaard tot 1934 toen Kunitz en Northrop de aanwezigheid van een enzym naast trypsine bevestigden en het chymotrypsine noemden. Zij waren in staat om chymotrypsine te kristalliseren, evenals de inactieve precursor, chymotrypsinogeen (Kunitz en Northrop 1934). In 1938 isoleerde Kunitz verschillende actieve vormen van chymotrypsine en duidde ze aan als alpha, beta, en gamma (Kunitz 1938).

In het begin van de jaren 1940 bestudeerden Fruton en Bergmann verder de specificiteit van chymotrypsine en rapporteerden verschillende nieuwe substraten (Fruton en Bergmann 1942). Jacobsen identificeerde al snel aanvullende vormen van chymotrypsine en noemde ze delta en pi (Jacobsen 1947). In 1948 karakteriseerde Schwert verder de molecuulgewichten van chymotrypsine en chymotrypsinogeen.

In 1954 werd het eerste bewijs voor het drie-stappen mechanisme van chymotrypsine die amide en ester substraten hydrolyseert gerapporteerd door Hartley en Kilby, die de aanwezigheid van een acyl enzymatussen veronderstelden, wat later waar bleek te zijn (Henderson 1970). In 1955 verkreeg Laskowski een tweede kristallijn chymotrypsinogeen, dat hij chymotrypsinogeen B noemde. In 1964 bepaalde Hartley de aminozuursequentie van chymotrypsine A, die later werd verfijnd door Meloun et al. in 1966. In 1968 bepaalden Smillie et al. de aminozuursequentie van chymotrypsine B, die 80% sequentie-identiteit vertoonde met chymotrypsine A. Gedurende de jaren 1970 en 1980 werd onderzoek gedaan om het werkingsmechanisme beter te begrijpen, en de verschillen in aminozuursequenties tussen trypsine en chymotrypsine te identificeren (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth en Polgár 1983, en Gráf et al. 1988).

In de jaren negentig werd chymotrypsine gezuiverd uit andere bronnen, waaronder Atlantische kabeljauw (Ásgeirsson en Bjarnason 1991), en kameel (Al-Ajlan en Bailey 1997). Er werd ook een begin gemaakt met het onderzoek naar remmers (Baek et al. 1990), en Frigerio et al. brachten de kristalstructuur van runderchymotrypsine tot een resolutie van 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Recent onderzoek heeft de vouwing en denaturatie van chymotrypsine over een reeks concentraties onderzocht (Ghaouar et al. 2010), de interactie van chymotrypsine met substraten van nanodeeltjes (You et al. 2006, en Jordan et al. 2009), en het verhogen van de stabiliteit van chymotrypsine door conjugatie met PEG-moleculen (Castellanos et al. 2005, en Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificiteit:

Chymotrypsine wordt geactiveerd door splitsing van de binding tussen arginine en isoleucine (R15 en I16) door trypsine, waardoor structurele wijzigingen optreden en de bindingsplaats van het substraat wordt gevormd (Sears 2010). Chymotrypsine verschilt van trypsine doordat trypsine peptiden splitst op arginine en lysine residuen, terwijl chymotrypsine de voorkeur geeft aan grote hydrofobe residuen (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsine katalyseert bij voorkeur de hydrolyse van peptide bindingen waarbij L-isomeren van tyrosine, fenylalanine, en tryptofaan betrokken zijn. Het werkt ook gemakkelijk op amiden en esters van vatbare aminozuren. Chymotrypsine’s specificiteit voor grote hydrofobe residuen kan worden verklaard door een hydrofoob S1 bindingspoced gevormd door residuen 189 tot en met 195, 214 tot en met 220, en 225 tot en met 228 (Cohen et al. 1981).

Hoewel de structuur van trypsine en chymotrypsine’s S1 site slechts één verschil vertonen (op positie 189), hebben plaatsgerichte mutagenese van trypsine en chymotrypsine geen uitwisseling van specificiteiten opgeleverd, wat suggereert dat het mechanisme waarmee trypsine en chymotrypsine substraatspecifieke katalyse bereiken niet volledig begrepen is (Steitz et al. 1969, en Gráf et al. 1988).

Moleculaire kenmerken:

Chymotrypsine A en B delen 80% sequentie-identiteit (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, en Gráf et al. 2004). De aminozuren van de katalytische triade (H57, D102, en S195) zijn sterk geconserveerd in de sequenties van de peptidasen van familie S1 (Gráf et al. 2004). Het serine op positie 214 is ook sterk geconserveerd in de familie en is voorgesteld als het vierde lid van de katalytische triade (Ohara et al. 1989, en McGrath et al. 1992).

Samenstelling:

De drie aminozuurresiduen van de katalytische triade (H57, D102, en S195) zijn essentieel voor de splitsing van peptidebindingen en worden gestabiliseerd door waterstofbruggen (Sears 2010, en Gráf et al. 2004). G193 en S195 vormen het oxyaniongat en interageren met de carbonylgroep van de scissile peptidebinding, waardoor deze georiënteerd wordt om het tetrahedral intermediair te vormen (Rühlmann et al. 1973, Huber en Bode 1978, en Gráf et al. 2004).

Proteïne Accessie Nummer: P00766

CATH Classificatie (v. 3.3.0):

• Klasse: Hoofdzakelijk bèta
• Architectuur: Beta Barrel
• Topologie: Trypsine-achtig serine protease

Moleculair gewicht:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Optimale pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoëlektrisch punt:

• 8.52 (Chymotrypsinogeen, Theoretisch)
• 8,33 (Chymotrypsine, Theoretisch)

Extinctiecoëfficiënt:

• 51.840 cm-1 M-1 (Theoretisch)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogeen, Theoretisch)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsine, Theoretisch)

Actieve Site Residuen:

• Histidine (H57)
• Aspartaat (D102)
• Serine (S195)

Activatoren:

• Cetyltributylammoniumbromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammoniumbromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammoniumbromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammoniumbromide (Spreti et al. 2001)

Remmers:

• Hydroxymethylpyrrolen (Abell en Nabbs 2001)
• Boronzuren (Smoum et al. 2003)
• Courmarinederivaten (Pochet et al. 2000)
• Peptidylaldehyden (Lesner et al. 2009)
• Peptiden uit natuurlijke bronnen (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, en Chopin et al. 2000)
• Peptiden die een onnatuurlijk aminozuur bevatten (Legowska et al. 2009, en Wysocka et al. 2008)

Toepassingen:

• Sequentie-analyse
• Peptidesynthese
• Peptide mapping
• Peptide fingerprinting