Celcultuur, virusamplificatie en -zuivering voor SHAPE-MaP en SPLASH experimenten

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) en Madin-Darby canine kidney (MDCK) cellen werden gekweekt in Minimum Essential Medium (Merck), aangevuld met 2 mM l-glutamine en 10% FCS. Voorraden WSN (H1N1)-virus werden geproduceerd door infectie van MDBK-cellen met het influenzavirus bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01. Virale voorraden van Udorn (H3N2) en PR8 (H1N1) (PR8) virussen werden geproduceerd door infectie van MDCK-cellen bij een MOI van 0,001 in de aanwezigheid van 0,8 ug ml-1 van n-Tosyl-l-fenylalanine-chloormethylketon (TPCK)-behandelde trypsine (Merck). Virussen werden 2 d na infectie verzameld. De virussen werden gezuiverd door ultracentrifugatie: eerst werd het geïnfecteerde celkweekmedium geklaard door centrifugatie bij 4.000 toeren per minuut gedurende 10 minuten bij 4 °C, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 toeren per minuut gedurende 15 minuten bij 4 °C. Het virus werd vervolgens gezuiverd door centrifugatie bij 10.000 toeren per minuut gedurende 15 minuten bij 4 °C. Het virus werd vervolgens gezuiverd door centrifugatie door een 30% sucrosekussen bij 25.000 omwentelingen per minuut gedurende 90 minuten bij 4 °C in een SW 32 rotor (Beckman Coulter). De gezuiverde virus pellet werd geresuspendeerd in een resuspensiebuffer (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). We merken op dat noch virion noch RNA tertiaire structuren worden verstoord door ultracentrifugatie30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP werd uitgevoerd volgens de gepubliceerde procotols17; 1-methyl-7-nitroisatoic anhydride (1M7) werd gesynthetiseerd uit 4-nitroisatoic anhydride zoals eerder beschreven33. Voor de in vitro getranscribeerd RNA experimenten, werd elk viraal RNA segment gesynthetiseerd uit een lineaire DNA-sjabloon met behulp van de HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). De producten werden gecontroleerd op grootte en zuiverheid op een 3,5% polyacrylamide gelelektroforese (PAGE)-urea gel. Naked virale RNA monsters werden bereid door het zuiveren van de WSN deeltjes over sacharose kussen zoals eerder beschreven. Gezuiverde virussen werden behandeld met 250 ug ml-1 van proteïnase K (Roche) in proteïnase K buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) gedurende 40 min bij 37 ° C. Vóór de wijziging, in vitro getranscribeerd RNA en naakt viraal RNA monsters werden gevouwen bij 37 ° C gedurende 30 min in vouw buffer (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (opgelost in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO; Merck)) werd toegevoegd aan een eindconcentratie van 10 mM aan de gevouwen RNA en de monsters werden geïncubeerd gedurende 75 s bij 37 ° C. De in virio modificaties werden uitgevoerd door 1M7 rechtstreeks aan gezuiverd virus toe te voegen. Het vermogen van SHAPE-MaP reagentia virale deeltjes doordringen werd aanvankelijk getest zoals eerder beschreven34 door het uitvoeren van 32P-gelabelde primer extensies op RNA geëxtraheerd uit SHAPE-MaP reagens-behandeld virus met behulp van een NA segment targeting primer (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Parallel aan de 1M7-behandelde monsters, werden controlemonsters behandeld met DMSO. n-methylisatoic anhydride (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP-reagens werd ook getest in virio. Experimenten met NMIA werden uitgevoerd zoals beschreven voor 1M7, behalve de gezuiverde virionen werden behandeld met NMIA gedurende 45 min.

Sequencing bibliotheek voorbereiding werd uitgevoerd zoals eerder beschreven17 volgens de randomer workflow. In het kort, na 1M7 of controle behandeling, werd RNA gezuiverd met behulp van de RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research). Het RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van de Random Primer Mix (New England Biolabs) met SuperScript II (Invitrogen) in MaP-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol en 0,5 mM deoxynucleoside trifosfaat). De Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) werd gebruikt om de DNA-bibliotheken te bereiden. Definitieve PCR amplificatie producten werden grootte-geselecteerd met behulp van Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) en de kwaliteit beoordeeld met de Agilent DNA 1000 kit (Agilent Technologies) op een Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies). Voor WSN, naakt viraal RNA en in vitro getranscribeerd RNA werden de bibliotheken gesequeneerd (2 × 150 basenparen (bp)) op een HiSeq 4000-systeem (Illumina); voor PR8- en Udorn-virussen werden de bibliotheken gesequeneerd (1 × 150 bp) op een NextSeq 500-systeem (Illumina).

SPLASH

SPLASH monsters werden bereid zoals eerder gepubliceerd24,35, met enkele wijzigingen, voor twee replicaten elk van WSN, PR8 en Udorn virussen en een enkele replicaat voor elk van de H3N2 reassortant virussen. Gezuiverd virus werd geïncubeerd met 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotine (Thermo Fisher Scientific) en 0,01% digitonine (Merck) gedurende 5 min bij 37 °C. Het virus werd verspreid over een schaal met 6 putjes, afgedekt met een glazen plaat, op ijs geplaatst en gedurende 45 min bestraald met een UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific). Verknoopt virus werd behandeld met proteinase K en viraal RNA werd geëxtraheerd met TRIzol (Invitrogen). Een aliquot van het geëxtraheerde viraal RNA werd gebruikt om biotine-opname te detecteren met behulp van een chemiluminescente Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) op een Hybond-N Nylon Membraan (GE Healthcare Life Sciences). De rest van het geëxtraheerde virale RNA werd gefragmenteerd met behulp van de NEBNext Magnesium RNA Fragmentatie Module (New England Biolabs) en grootte-geselecteerd voor fragmenten korter dan 200 nt met behulp van de RNA Clean & Concentrator-5 Kit. De monsters werden verrijkt voor gebiotinyleerd viraal RNA met behulp van Dynabeads MyOne Streptavidine C1 kralen (Thermo Fisher Scientific); on-bead proximity ligatie en psoralen-cross-link omkering werden uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 24,35. Sequencing bibliotheken werden bereid met behulp van de commerciële SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). Definitieve grootte selectie werd gedaan door het uitvoeren van de PCR-amplified sequencing bibliotheken op een 6% PAGE gel (Thermo Fisher Scientific) in Tris / boorzuur / EDTA (TBE), het selecteren van 200-300 bp DNA. Bibliotheken werden gesequenced 1 × 150 bp op een NextSeq 500 System.

Verwerking van SHAPE-MaP sequencing leest

Sequencing leest werden getrimd om adapters met behulp van Skewer v0.2.2 (ref. 36) te verwijderen. De SHAPE-MaP reactiviteit profielen werden gegenereerd met behulp van de gepubliceerde ShapeMapper2 pijplijn37, die de leest uitgelijnd met het referentiegenoom en berekent mutatiepercentages op elke nucleotide positie. De mutatiesnelheden zijn vervolgens omgezet in SHAPE-MaP-reactiviteitwaarden, die als volgt gedefinieerd zijn:

waarbij mutr1M7 de mutatiesnelheid van de nucleotiden in het met 1M7 behandelde monster is en mutrDMSO de mutatiesnelheid in het met DMSO behandelde monster. Alle SHAPE-MaP-reactiviteitscijfers zijn genormaliseerd tot een schaal van ongeveer 0-2 door de SHAPE-MaP-reactiviteitscijfers te delen door de gemiddelde reactiviteit van de 10% meest reactieve nucleotiden na uitsluiting van uitschieters (gedefinieerd als nucleotiden met reactiviteitswaarden die >1,5 het interkwartielbereik). Hoge SHAPE-MaP reactiviteiten geven meer flexibele (dat wil zeggen, single-stranded) regio’s van RNA en lage SHAPE-MaP reactiviteiten geven meer structureel beperkt (dat wil zeggen, base-paired) regio’s van RNA.

Verwerking van SPLASH sequencing leest

Sequencing leest werden getrimd om adapters met behulp van Skewer v0.2.2 (ref. 36) te verwijderen. STAR v.2.5.3 (ref. 38) werd gebruikt om de leest uit te lijnen met de juiste virus referentiegenoom (Supplementary Tabel 2). Alleen de chimeer leest waar ten minste 20 nt uitgelijnd met de referentie-segmenten werden gebruikt in verdere verwerking (STAR parameter: -chimSegmentMin 20). Chimerische gelezen werden gededupliceerd met behulp van CIGAR strings en uitlijning posities. CIGAR strings in elke read alignment werden verwerkt om de read start en eind coördinaten te vinden. Chimerische gelezen coördinaten werden gebruikt om een matrix van sequentie interacties in de R software te produceren. Discrete loci in de matrix werden geselecteerd en individueel voorzien van een Gaussische curve gebaseerd op de intensiteit van de leesoverlap om een interactievenster te definiëren; interactievensters van complex overlappende loci werden gescheiden in individuele vensters. De breedte van het interactie venster werd gebruikt om de start-en eindcoördinaten van elke interactie te bepalen; het aantal gelezen dat binnen (of gedeeltelijk binnen) dit gebied werd gebruikt als een maat voor de interactie frequentie. Voor het genereren van figuren, werden de top 20 interacties in elk virus gevisualiseerd met behulp van de circlize pakket v.0.4.5 (ref. 39) in R v.3.5.1. De volledige set van interactie loci wordt gegeven in aanvullende tabel 2. Voor qPCR validatie van interacterende loci, werden psoralenen-cross-linked monsters bereid en verrijkt zoals eerder beschreven, maar met een verkorte fragmentatie tijd (3 versus 4 min) om langer RNA fragmenten te genereren. RNA werd gepolyadenyleerd met Poly (A) Polymerase (Takara Bio) en complementair DNA werd gegenereerd met behulp van de smRNA dT Primer (Takara Bio) en PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) volgens de instructies van de fabrikant. Een 50-cyclus qPCR werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant op een StepOnePlus-instrument (Applied Biosystems) met behulp van de Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix met ROX (Agilent Technologies) en primerparen om te testen op intersegment interacties. Primer sequenties worden gegeven in aanvullende tabel 3. Na 50 cycli van qPCR amplificatie, werden producten opgelost door 8% PAGE (29:1 acrylamide / bis-acrylamide, 1 × TBE buffer) en gevisualiseerd met blauw licht transilluminatie.

RNA structuur voorspellingen

De IntaRNA algoritme v.2.3.1 (ref. 40) werd gebruikt om het vermogen van RNA-RNA interacties te voorspellen op te treden in de regio’s die tijdens de SPLASH analyse, met behulp van de Exact mode (-modus E) en geen zaad beperking (-noSeed) opties. SHAPE-MaP reactiviteiten werden opgenomen in de modellering van RNA-RNA interacties (-tShape en -qShape). Gepermenteerde datasets werden gegenereerd door willekeurig schudden van de specifieke interactie partners geïdentificeerd door SPLASH en de beoordeling van de interactie ΔG energieën met behulp van IntaRNA. De significantie van het verschil tussen de kansverdelingen van de ΔG energieën geassocieerd met de SPLASH-geïdentificeerde intermoleculaire RNA interacties versus de gepermuteerde datasets werd berekend met behulp van de Wilcoxon rank-sum test in de R-software. De IntaRNA structuur voorspellingen werden vervolgens gebruikt om de interactie regio’s trimmen tot de nucleotiden die betrokken zijn bij de base pairing. Waar SHAPE-MaP gegevens niet beschikbaar waren (PR8 reassortanten met H3N2 virussen), werd pre-vouwen van elke RNA streng (’toegankelijkheid’) uitgeschakeld in IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Voor validatie tegen bekende structuren, werden RNA secundaire structuur gegevens geëxtraheerd uit de RNA3Dhub database41, op basis van de cryogene elektronenmicroscopie structuren van de 80S ribosoom42 (PDB: 6EK0) en van de U4 / U6.U5 drievoudige kleine nucleaire ribonucleoproteïne spliceosomale complex43 (EMDB: EMD-2966). Referentie RNA sequenties werden gecorrigeerd om runderen (MDBK) sequenties voor ribosomaal RNA en U4 / U6 kleine nucleaire RNA’s overeenkomen, zoals eerder beschreven44. Voor intramoleculaire RNA structuur voorspellingen, werd de ViennaRNA pakket v.2.0 (ref. 45) gebruikt. De RNAfold commando werd gebruikt om secundaire RNA structuren en partitie functies te voorspellen voor elk segment. SHAPE-MaP reactiviteiten werden opgenomen als pseudo-energie beperkingen. Een 50 nt glijdende mediaan venster correlatie-analyse tussen de ex virio en in virio SHAPE-MaP reactiviteit profielen werd gebruikt om de mate van SHAPE-MaP correlatie tussen T7-getranscribeerde en vRNP-geassocieerd RNA te bepalen. Wij vonden dat er geen correlatie bestond >150 nt; daarom stelden wij de maximale parenafstand beperking voor structuur en partitie functie voorspellingen in op 150 nt. Voor intramoleculaire structuurvoorspellingen stelden we de nucleotiden binnen de promotorregio in op enkelstrengs.

Celcultuur voor reverse-engineering van influenzavirussen

MDCK-cellen en menselijke embryonale niercellen (HEK 293T) waren afkomstig van een bestaande collectie in het Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne. MDCK-cellen werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Sigma-Aldrich) en HEK 293T-cellen werden gekweekt in DMEM (Thermo Fisher Scientific). Beide media werden aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FCS, 2 mM l-glutamine, 2 mM natriumpyruvaat, 24 ug ml-1 gentamicine, 50 ug ml-1 streptomycine en 50 IE ml-1 penicilline. Coculturen van MDCK-cellen en HEK 293T cellen voor transfectie werden gevestigd in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) met 50 μg ml-1 streptomycine en 50 IU ml-1 penicilline.

Constructie van reverse-engineered influenzavirussen

Individuele gensegmenten van PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) en Wyo03 (H3N2) virussen werden reverse-transcribeerd en gekloond in pHW2000 plasmiden46. De reverse genetics-afgeleide virussen bevatten ofwel een PR8-, Udorn-, Mem71-, PC73- of Wyo03 PB1-gen met ofwel een wild-type ofwel een gemodificeerd NA-gen in een genetische achtergrond die zes segmenten van het PR8-virus omvat (PB2, PA, HA, NP, M en NS). Het gemodificeerde NA-gen (Wyo03UdSub) was afgeleid van Wyo03 en droeg 4 substituties in de Udorn-NA-sequentie: de nucleotiden G943A; C938U; U933C; en G923A. Drie van deze vier nucleotide veranderingen waren stil, terwijl de vierde (A534G) resulteerde in een conservatieve lysine naar arginine verandering (K172R). Complementaire fragmenten waarin deze veranderingen werden gegenereerd door PCR en samengevoegd door een andere ronde van PCR met segment-specifieke primers die BsmBI restrictie sites47; het product werd gekloond in de pHW2000 expressie vector voor virus redding. Primer-sequenties worden gegeven in supplementaire tabel 3. Geredde virussen werden geamplificeerd in 10-d geëmbryoneerde kippeneieren. Infectieuze allantoïsche vloeistof werd getitreerd voor virusgehalte door plaquevorming in MDCK-cellen48 en opgeslagen bij -80 ° C.

Bepaling van virale replicatiekinetiek van reverse-engineered virussen

De replicatie kenmerken van de reverse-engineered virussen werden bepaald door infectie van MDCK-cellen bij een MOI van 0,01. Na 1 uur absorptie (op t = 0 h) werd het inoculum verwijderd en werden de cellen gewassen en geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2 in RPMI 1640, aangevuld met 2 mM l-glutamine, 2 mM natriumpyruvaat, 24 μg ml-1 gentamicine, 50 μg ml-1 streptomycine, 50 IE ml-1 penicilline en 1 μg ml-1 met TPCK behandelde trypsine (Worthington Biochemical Corporation). Celcultuursupernatanten werden verzameld op verschillende tijdstippen na infectie en bewaard bij -80 °C voor analyse. Virale titers werden bepaald door plaquevorming op confluente monolayers van MDCK-cellen.

Nine-plasmide competitieve reverse-engineering van influenzavirussen

Competitieve reverse-engineering van influenzavirussen werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste versie van de acht-plasmide reverse genetics systeem26 zoals eerder beschreven25. In het kort werden plasmiden die coderen voor PB2, PB1, PA, hemagglutinine (HA), nucleoproteïne (NP), matrixproteïne (M) en niet-structureel eiwit (NS) virale RNA-segmenten van PR8 geco-transfecteerd met plasmiden die coderen voor neuraminidase (NA) viraal RNA en concurrerend PB1 viraal RNA van ofwel Udorn, Mem71, PC73 of wild-type of gemodificeerd Wyo03. Elk plasmide (1 µg) werd gemengd met FuGENE 6 transfectiereagens (Promega) in Opti-MEM en toegevoegd aan een cocultuur van HEK 293T en MDCK cellen. Zes uur na de transfectie, werd de media vervangen door Opti-MEM aangevuld met 50 ug ml-1 streptomycine en 50 IE ml-1 penicilline. Vierentwintig uur later, TPCK-behandelde trypsine (1 ug ml-1) werd toegevoegd en het supernatant verzameld na een verdere 42 uur en bewaard bij -80 ° C. Om de incorporatiefrequenties van de concurrerende PB1-genen te bepalen, werden de nageslachtvirussen in het transfectiesupernatans onderworpen aan een plaqueproef in MDCK-cellen. Willekeurig gekozen plaques (ongeveer 36 per experiment) werden geplukt door bemonstering door de agarose en geresuspendeerd in 0,05% Triton-X100. De bron van de concurrerende gensegmenten werd geïdentificeerd door gen-specifieke kwantitatieve RT-PCR met behulp van de SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kit (Bioline). Elke reactie van 20 μl werd uitgevoerd met 5 μl geplaceerde virussuspensie, 10 μl 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0,2 μl reverse transcriptase, 0,4 μl Ribosafe RNase inhibitor, 0,8 μl van elke 10 μM gen-specifieke forward en reverse primer en 0,08 μl van elke 25 μM gen-specifieke probe. Primer en probe sequenties worden gegeven in supplementaire tabel 3. De RT-PCR-reactie werd geïncubeerd gedurende 10 min bij 45 ° C, alvorens over te gaan tot qPCR amplificatie, volgens de instructies van de fabrikant. De gerapporteerde waarden zijn gecombineerde gegevens van 3-8 onafhankelijke transfectie-experimenten voor elke competitie.

Reporting Summary

Verder informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.