Abstract
In dit werk wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van de ultrastructuur van de secretorische cellen van de pancreaseilandjes van de Zuid-Amerikaanse meerval Rhamdia quelen. Er wordt bewijs geleverd voor de stelling dat de α-granules bestaan uit een centraal en een buitenliggend gedeelte met verschillende elektronendichtheden en oplosbaarheden, dat de δ-cellen hoogstwaarschijnlijk morfologisch veranderde maar levensvatbare α-cellen zijn, en dat de β-granules mogelijk een repeterende substructuur bezitten en daarom een intracellulaire kristallijne opslagvorm van insuline kunnen vertegenwoordigen.
1. Inleiding
De eilandjes van Langerhans werden door Langerhans in 1869 bij het konijn ontdekt. Zij werden echter ongeveer 20 jaar eerder door Stannius en Blockmann bij teleosts gerapporteerd en worden daarom ook, hoewel minder frequent, de lichaampjes van Stannius of Blockmann genoemd. De eilandjes van Langerhans zijn van endodermale oorsprong en worden bij de meeste teleoesten aangetroffen als kleine lichaampjes verspreid in het exocriene deel van de pancreas.
De vis heeft geen afzonderlijke pancreas. Exocrien pancreasweefsel kan verspreid langs het darmkanaal worden aangetroffen. De acinaarstructuur van de exocriene pancreas lijkt sterk op die van zoogdieren en bestaat uit cellen met een zeer donker, basofiel cytoplasma . Bij actief etende vissen bevatten zij grote aantallen heldere eosinofiele, secretorische granules. De endocriene pancreaseilandjes van Langerhans konden worden onderscheiden, en het weefsel omvat α-cellen (die glucagon-achtig peptide produceren), β-cellen (die insuline produceren), en d-cellen (die somatostatine produceren) . Bij zoogdieren en mensen de meeste van de eerdere elektronenmicroscopische beschrijvingen van volwassen menselijke pancreas eilandjes zijn beknopt en kleine delen van publicaties zijn voornamelijk gewijd aan beschrijvingen van β-cel tumoren of overzichtsartikelen bespreken van de vergelijkende morfologie van de eilandjes van verschillende soorten .
De vis pancreas blijkt niet vaak een kant en klare bron van weefsel voor elektronenmicroscopische studie. De hoofdpancreas van de vis is zowel anatomisch als ontwikkelingsmatig vergelijkbaar met de pancreas van zoogdieren, terwijl bij andere vissoorten grote verschillen te zien zijn. Bij volwassen zebravissen bevat de hoofdpancreas verscheidene hoofd-eilanden omgeven door exocrien weefsel. Een staart van afzonderlijke eilandjes, ingebed in exocrien weefsel en vet, strekt zich caudaal uit langs de darm. De β-cellen van tilapia (een andere glucosegevoelige teleostvis) bevinden zich daarentegen in eilandjes van Langerhans die zich langs het mesenterium bevinden en niet omgeven zijn door exocrien weefsel. Rhamdia quelen is een teleostsoort en is een belangrijke soort voor de aquacultuur in subtropische klimaten. R. quelen wordt aangetroffen van Zuid-Mexico tot Centraal-Argentinië, en de kweek van deze soort breidt zich uit naar Zuid-Brazilië.
In de huidige studie analyseren wij de ultrastructuur van de eilandjes van Langerhans en beschrijven in detail de verschillende types van secretorische cellen in Zuid-Amerikaanse meervallen R. quelen.
2. Materialen en Methoden
Vier gekweekte R. quelem twee wijfjes en twee mannetjes ( g; cm) afkomstig van het Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) in de noordoostelijke regio van Argentinië en uitgezet in 200 L tanks waar ze twee weken geacclimatiseerd waren vóór de necropsie. De vissen werden gekweekt met gefilterd zoet water dat op 25°C werd gehouden met een waterverversingssnelheid van 100% per dag. De fotoperiode werd ingesteld op 12 uur donker en 12 uur licht. Ze werden viermaal per dag met de hand gevoederd met commercieel voedsel (Ganave). De vissen werden geëuthanaseerd met benzocaïne (500 ppm) en gecastreerd en monsters van het vet dat zich caudaal langs de darm uitstrekt, werden gefixeerd in 10% gebufferde formaline, ingebed in paraffine en gekleurd met hematoxyline en eosine (H3189>E).
Kleine fragmenten van het weefsel werden in blokjes van 1 mm gesneden en onmiddellijk gefixeerd in fosfaatgebufferde glutaaraldehyde (pH 6.9 bij 4 ° C), gewassen in Millonig’s oplossing, en postfix in 1% osmiumtetroxide; het weefsel blokken werden vervolgens gedehydrateerd in een graded reeks van ethanol-aceton, ondergedompeld in propyleenoxide, en ingebed in Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Zwitserland). Dunne coupes werden gesneden met een LKB ultramicrotoom en dubbel gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat vóór onderzoek in een Jeol JEM-8T elektronenmicroscoop (Jeol, Tokyo, Japan).
3. Resultaten
3.1. Lichtmicroscopie
R. quelen hebben pancreas verspreid over het vetweefsel rond de gemeenschappelijke galbuis; deze ligt binnen een ruwweg driehoekig gebied dat superieur begrensd wordt door de maag, anterior door de lever, en inferior door de milt en de galblaas. Elk eilandje van Langerhans bestaat uit betrekkelijk zuiver eilandjesweefsel omgeven door exocriene pancreas (figuur 1). Er werden geen verschillen tussen mannen en vrouwen waargenomen.
3.2. Elektronenmicroscopie
De β-cellen, die gewoonlijk het inwendige van de eilandjes innemen, werden gewoonlijk, maar niet altijd, van de exocriene pancreas gescheiden door de perifeer gelegen α-cellen (figuur 2). Het ultrastructurele aspect van de β-cellen was identiek bij de monsters van de vier vissen. De kenmerkende β-granules bevonden zich in gladde, gemembraneerde zakjes en varieerden in grootte en vorm. Er waren rechthoekige, vierkante, zeshoekige en onregelmatig veelhoekige kristallen zichtbaar. Ronde vormen waren aanwezig, maar minder vaak (Figuren 2 tot 5). Elke korrel bestond uit één of meer kristallijne of niet-gestructureerde vormen van uiteenlopende grootte en vorm. De keuze van het fixeermiddel bleek de inwendige structuur van de β-korrels niet te beïnvloeden. Binnen de grenzen van het omhullende membraan leek het gebied rond de kristallen leeg of bevatte het een fijn vlokkig neerslag, ongeacht het gebruikte fixeermiddel. Bij hogere vergrotingen was soms een zich herhalende substructuur zichtbaar in de kristallen die goed georiënteerd waren ten opzichte van het vlak van de doorsnede (Figuren 6 en 7). De talrijke mitochondriën waren over de hele cel verspreid en verschenen als afgeronde of volumineuze filamenteuze structuren. Zij waren groter en talrijker dan die van de β-cel, maar gewoonlijk kleiner dan die van de pancreatische acinarcellen. De talrijke mitochondriale cristae waren meestal transversaal georiënteerd en mitochondriale granules waren aanwezig maar niet prominent. De cisternae van het granulair endoplasmatisch reticulum waren gewoonlijk kort of vesiculair (Figuren 2 tot 4). Het korrelige endoplasmatische reticulum en de vrije ribosomen waren niet zo prominent aanwezig in de β-cellen als in de acinare of β-cellen. De β-cellen met weinig secreterende korrels waren normaliter rijker bedeeld met ribosomen en korrelig endoplasmatisch reticulum, dat dan vaker cisternaal van configuratie was (figuur 5).
Het Golgi-complex was prominenter aanwezig na fixatie met aldehyde en de samenstellende structuren waren meer uitgezet (figuur 2). Na gebruik van deze fixeermiddelen was af en toe dicht amorf materiaal zichtbaar binnen de Golgi-blaasjes, dat onrijpe granules of voorlopers van de β-secretorische granules kan vertegenwoordigen. De kernen van de β-cellen waren gewoonlijk bolvormig en relatief glad van contour. Het celmembraan van aangrenzende eilandjescellen lag dicht bij, hoewel niet vaak verbonden door, desmosomen. Op het kruispunt van drie of meer cellen waren de begrenzende membranen vaak gekronkeld, met kronkelige interdigitaties van de cellen (Figuren 2 en 9). Multivesiculaire cytoplasmatische insluitsels die lijken op ceroïden waren opvallend in de meeste β-cellen (Figuren 2, 7, 9, en 8). Het verschijnen en de frequentie van deze insluitsels werden niet merkbaar beïnvloed door het primaire gebruik van osminezuur of aldehyde als fixatief, en er was geen duidelijk verband tussen de aanwezigheid van deze korrels en het morfologische bewijs van fysiologische activiteit door de cellen. De ultrastructuur van de α-cellen was in alle vier weefselmonsters dezelfde. De grootte en vorm van deze cellen en van hun kernen verschilden niet significant van die van normale β-cellen (Figuren 2 en 7). Hoewel af en toe een α-cel met een onregelmatig gevormde of een ingedeukte kern werd aangetroffen, kwam dit niet vaak genoeg voor om als een bruikbaar differentiërend criterium te kunnen dienen. De cytoplasmatische korrels van de α-cellen bleven bij primaire osmiumfixatie bewaard als dichte, sferische lichamen van variabele grootte en bevonden zich in losjes passende, glad gemembraneerde zakjes (Figuren 7 en 9). Ze waren groter dan de β-granules, maar aanzienlijk kleiner dan de zymogene granules van de acinarcellen (Figuur 2). De slanke, langgerekte mitochondriën waren middelmatig in aantal en kleiner dan die van de β-cellen en bezaten cristae die gewoonlijk dwarsgeoriënteerd waren. Het korrelige endoplasmatisch reticulum was vaak cisternaïsch van configuratie en overvloediger dan in de β-cellen (figuur 9). Het Golgi-complex was, wanneer zichtbaar, van matige proporties. Dichte amorfe materialen binnen Golgi-blaasjes en cisternae, vermoedelijk de voorlopers van de secreterende granules, kwamen vaker voor in α-cellen dan in β-cellen (figuur 10). Ceroïde lichaampjes, hoewel vaak zichtbaar, waren minder talrijk dan in de β-cellen (figuren 2 en 3). De zakjes waarin de α-granules zich bevinden, bleken dus volledig gevuld te zijn, en er werd geconcludeerd dat de granules bestaan uit een afgeronde binnenste dichte kern en een buitenste minder elektronendichte mantel die afwezig was na osmiumfixatie (figuren 3 en 9) en daardoor wellicht beter oplosbaar was. Er was geen consistente substructuur zichtbaar in de binnenste of de buitenste delen van de α-granules. Op geen enkel moment werden cellen waargenomen die konden worden geïnterpreteerd als overgangsvormen tussen α-cellen en β-cellen. De α-granules, met inbegrip van zowel de buitenste als de binnenste meer dichte gedeelten, waren in totale omvang vergelijkbaar met de δ-granules. Bovendien zijn tussenliggende cellen aanwezig die granules van beide typen bevatten, hetgeen suggereert dat de δ-cellen in feite gemodificeerde α-cellen waren (figuur 10). De δ-cellen zijn gevisualiseerd, hoewel ze zich bijna altijd tussen de α-cellen bevinden, en zijn ultrastructureel van de α-cellen geïdentificeerd en onderscheiden op basis van de lagere elektronendichtheid en de grotere totale grootte van hun secretorische granules. Bovendien zijn tussenliggende cellen aanwezig die granules van beide typen bevatten, wat suggereert dat de δ-cellen in feite gemodificeerde α-cellen waren (figuur 11).
Hoewel er een omgekeerd evenredig verband bestond tussen het aantal secreterende granules en de prominentie van het Golgi-complex en het granulair endoplasmatisch reticulum, werd er geen patroon van vrijkomen van α- of β-granules waargenomen. Een dun keldermembraan en variërende hoeveelheden bindweefsel scheidden gewoonlijk de pancreaseilandjes van de aangrenzende acinarcellen (figuur 2). Af en toe, echter, geen keldermembraan tussen eilandjes en acinar cellen die dan werden gescheiden alleen door de smalle interstitiële ruimte. De gefenestreerde capillaire endotheelcellen waren altijd van hen gescheiden door ten minste het capillaire keldermembraan (figuur 9). Andere ondersteunende elementen, waaronder collageen en elastische weefselcomponenten, waren soms ook aanwezig. Er werden geen verschillen tussen mannetjes en vrouwtjes waargenomen.
4. Discussie
Vis β-cellen zijn gemakkelijk te onderscheiden van de α-cellen door de morfologie van de secretorische korrels. De frequente aanwezigheid van hoekige subeenheden en de zich herhalende substructuur suggereren een kristallijne aard van de β-granules. Pogingen om de afmetingen van een kristalrooster op te lossen en te meten zijn tot nu toe niet succesvol geweest. Wanneer secretorische granules werden gevisualiseerd in de nabijheid van het Golgi complex, werden kristallijne subeenheden meestal niet waargenomen. Het is daarom verleidelijk te speculeren dat de niet-kristallijne granules of het amorfe materiaal binnen het Golgi-complex een andere chemische of fysische vorm van insuline of insuline-eiwitcomplex vertegenwoordigt dan de kristallijne subeenheden van de granule. Het is niet bekend of deze verschillende morfologische vormen binnen de β-granules verschillende oplosbaarheden hebben en wellicht verschillende afgiftepatronen als reactie op fysiologische vraag. Afscheidende granules werden niet waargenomen in de cisternae of vesikels van het granulaire endoplasmatische reticulum. Aangenomen wordt dat, zoals bij andere eiwit afscheidende cellen, het Golgi complex fungeert om het in het granulaire endoplasmatische reticulum gesynthetiseerde product te concentreren of te “verpakken”. Hieruit zou logischerwijze volgen dat de gladde-membraanzakjes waarin de secretorische granules zich bevinden, afkomstig zijn van Golgi-membranen en niet van het granulaire endoplasmatische reticulum.
De α-cellen met hun grote, afgeronde, dichte secretorische granules lijken vrij veel op α-cellen van andere soorten. Hoewel de korrels van de α-cellen sterk in afmeting variëren, bleken de meeste cellen een assortiment van korrels van verschillende grootte te bezitten, waardoor een subclassificatie van dit celtype, zoals voor andere soorten is gesuggereerd, uitgesloten is. Tot op heden zijn er geen fysiologische gegevens gepubliceerd die het bestaan van de “δ-cel” in de vis pancreatische eilandjes ondersteunen. De verschillende protagonisten hebben het bestaan van de δ-cellen ondersteund met gegevens die gebaseerd zijn op lichtmicroscopische onderzoeken van grillig zilver, fosforzuur-hematoxyline, en andere granulaatkleuren of elektronenmicroscopische studies van slecht geconserveerde weefsels. De hier gepresenteerde microfoto’s ondersteunen de mening van Bloom in 1931 en vervolgens van Gomori in 1941 dat δ-cellen gemodificeerde α-cellen zouden kunnen vertegenwoordigen.
De overgang van de typische α-granule, met binnenste dichte en buitenste minder dichte delen, naar een δ-granule van ongeveer dezelfde grootte, met uniforme maar verminderde dichtheid, gaat dikwijls gepaard met een geleidelijk verlies van morfologische integriteit of kleurintensiteit van mitochondriën, Golgi-complex, en de membraneuze componenten van het granulaire endoplasmatische reticulum. De intacte en levensvatbaar lijkende kernen, alsmede de persistentie van kleine aantallen vrije ribosomen en ceroïde lichaampjes, suggereren dat de zogenaamde δ-cellen levensvatbaar zijn, zelfs in het veronderstelde eindstadium van deze overgang, d.w.z. wanneer de secreetkorrels zelf niet langer zichtbaar zijn en alle cytoplasmatische organellen behalve ceroïde korrels en ribosomen afwezig zijn. Bij gebrek aan fysiologische gegevens die een functie toekennen aan de δ-cellen en bij gebrek aan meer overtuigend morfologisch bewijs voor een afzonderlijk celtype, wordt gehoopt dat de presentatie hier van een waarschijnlijke overgang van α-cellen naar δ-cellen zal worden aanvaard als de meest waarschijnlijke verklaring van de derde granulaire cel van Bloom bij de mens. De betekenis van deze levensvatbare maar veranderde α-cellen is niet bekend. Hoewel α- en β-cellen, afzonderlijk of in kleine clusters, kunnen worden gezien binnen acini en ducts, werden op geen enkel moment in een van de vier onderzochte pancreasmonsters tussenvormen tussen acinar en islet of duct en islet cellen gezien, zoals was gesuggereerd door Nakamura en Yokote (4).
Belangenconflict
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Acknowledgment
L. A. Romano ontving productiviteitsonderzoeksbeurzen van de Braziliaanse Raad voor Onderzoek, CNPq (procesnr. PQ 301002/2012-6).