Resultaten en Discussie
Twee wegen voor Pt-oxidatie in E. coli. Genetische studies hebben aangetoond dat het enzym C-P lyase, gecodeerd door het phn operon, in staat is Pt te oxideren (26). In een recente studie (9) waren we echter verbaasd te zien dat sommige E. coli phn mutanten nog steeds in staat waren Pt te oxideren. Onderzoek van het genotype van deze stammen suggereerde dat de phoA locus betrokken zou kunnen zijn bij Pt oxidatie. Om deze hypothese rechtstreeks te testen, onderzochten we E. coli-stammen die enkel verschilden in de phn- en phoA-loci op hun vermogen om Pt te oxideren, zoals aangetoond door hun vermogen om te groeien op media met Pt als enige Pt-bron. Omdat fosfaat nodig is voor groei, kunnen organismen niet groeien op dit medium tenzij ze de capaciteit hebben om Pt te oxideren tot fosfaat. Stammen die ofwel phoA + ofwel phn + waren, groeiden op Pt-medium (ongeacht of de andere locus gemuteerd was), terwijl stammen met mutaties in zowel phn als phoA dat niet deden (Fig. 1). Daarom heeft E. coli twee routes voor de oxidatie van Pt: een die phn-afhankelijk is en een die phoA-afhankelijk is.
Ter ondersteuning van deze hypothese, ontdekten we Pt-afhankelijke H2 productie zowel in vitro als in vivo. In-vitro-tests werden aëroob uitgevoerd in afgesloten flacons met gebruikmaking van sterk gezuiverd BAP. Na incubatie, werd de headspace geanalyseerd voor H2, en het waterige gedeelte werd geanalyseerd voor fosfaat. Zoals te zien in Fig. 2B , stoichiometrische hoeveelheden fosfaat en H2 werden geproduceerd uit Pt in aanwezigheid van BAP, terwijl noch fosfaat noch H2 werd geproduceerd in controlereacties met ofwel BAP of Pt alleen.
De producten van de BAP-gekatalyseerde Pt oxidatie zijn fosfaat en moleculaire H2.(A) De proton ontkoppeld 31P kernspinresonantie spectra en piekposities zijn aangegeven voor 5 mM Pt en 5 mM fosfaat controles, evenals voor een overnacht reactie die aanvankelijk bevatte 5 mM Pt plus 500 ug gezuiverd BAP. Een piek voor ongereageerd Pt en een nieuwe fosfaatpiek zijn duidelijk in het spectrum van de enzymatische reactie, maar er werden geen andere producten geproduceerd. De lichte verschuiving in de positie van de fosfaatpiek tussen de controle en het BAP-gekatalyseerde reactieproduct is te wijten aan kleine pH-verschillen: toevoeging van een fosfaatvoorraadoplossing aan de test verhoogde de hoogte van de pi-piek, maar leverde geen extra pieken op. De protongekoppelde spectra zijn volledig in overeenstemming met deze interpretatie (gegevens niet weergegeven). (B) BAP-gekatalyseerde Pt-oxidatie produceert stoichiometrische hoeveelheden fosfaat en moleculaire H2. In vitro reacties met de aangegeven componenten werden ’s nachts geïncubeerd bij 37 ° C in verzegelde flesjes. De headspace atmosfeer werd vervolgens geanalyseerd voor H2 door gaschromatografie met thermische geleidbaarheid detectie, terwijl de waterige fase werd geanalyseerd voor fosfaat met behulp van de malachietgroen assay. De reacties (3 ml) werden uitgevoerd in 50 mM Mops (pH 7,0) met 50 mM Pt (pH 7,0) en 387 μg gezuiverd BAP, zoals aangegeven. Drievoudige controles met ofwel BAP of Pt alleen werden uitgevoerd, maar noch fosfaat noch H2 werd gedetecteerd onder deze omstandigheden. De in vivo resultaten tonen de hoeveelheid H2 die geproduceerd wordt tijdens de groei van WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) in 0,4% glucose/Mops-bouillon met 2,5 μmol van de aangegeven P-bron. Aangezien dit P-niveau (500 μM) de groei beperkt, wordt verwacht dat de P-bron volledig geassimileerd is wanneer de culturen verzadigd zijn. Na overnachting groei bij 37 ° C in verzegelde flesjes, werd de headspace geanalyseerd voor H2 door gaschromatografie met thermische geleidbaarheid detectie. Zowel de in vitro en in vivo experimenten werden uitgevoerd aëroob (dat wil zeggen, O 2 aanwezig was tijdens Pt oxidatie).
Meting van H2 in vivo wordt bemoeilijkt door het feit dat E. coli heeft meerdere hydrogenasen die zowel kan produceren en verbruiken H2. Om dit probleem te omzeilen, construeerden we een ΔhypABCDE mutant, die geen actieve hydrogenasen kan produceren vanwege het onvermogen om de precursor eiwitten rijpen (32). De hyp mutant, aeroob gekweekt in afgesloten buizen, produceerde ook ruwweg stoichiometrische hoeveelheden H2 in culturen gekweekt met groeibeperkende niveaus van Pt, terwijl geen H2 werd gedetecteerd in culturen gekweekt met beperkende niveaus van fosfaat of de fosfaat ester fosfoserine (Fig. 2B ).
Pt oxidatie is niet een gemeenschappelijk kenmerk van alle alkalische fosfatasen. Efficiënte Pt oxidatie blijkt een uniek kenmerk van E. coli alkalische fosfatase te zijn. Noch Bacillus subtilis, waarvan bekend is dat ze meerdere zeer actieve fosfatases produceert (33), noch P. stutzeri, waarvan bekend is dat ze een fosfatase produceert dat verschilt van BAP (in stammen die het Pt dehydrogenase systeem missen) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, and W.W.M., ongepubliceerde gegevens), kan Pt gebruiken als enige Pt-bron (Fig. 3A ), hoewel beide organismen groeien op media met fosfoserine als enige P-bron (gegevens niet weergegeven). De fosfatases geproduceerd door deze organismen zijn dus niet in staat om Pt te oxideren in hoeveelheden die voldoende zijn om de groei te ondersteunen. We testten ook commerciële preparaten van kalfsintestinale fosfatase (CIP) en alkalische garnalenfosfatase (SAP) op hun vermogen om fosfaat uit Pt te produceren (Fig. 3B ). Hoewel kleine hoeveelheden fosfaat werden geproduceerd door de eukaryote fosfatasen na een nacht incubatie, was alleen E. coli BAP in staat om de reactie te katalyseren in een significant tempo. Deze bevinding is bijzonder verrassend omdat de eukaryote enzymen in feite veel betere fosfatasen zijn, met specifieke activiteiten die tot 40-maal hoger zijn dan BAP (27). Deze enzymen delen allemaal een aanzienlijke homologie (25-35% identiteit) met het E. coli BAP; bovendien zijn de meeste van de actieve-site residuen, waaronder Ser-102 (dat een covalent fosfo-enzym tussenproduct vormt tijdens de fosfatase reactie), geconserveerd (27).
Pt oxidatie is uniek voor E. coli alkalische fosfatase. (A) Het vermogen van B. subtilis en P. stutzeri om Pt te oxideren, zoals aangetoond door groei op media met Pt als de enige P-bron, werd getest, zoals beschreven in Fig. 1. Geen van beide organismen groeide op het Pt-medium, terwijl beide organismen groeiden op het fosfaatmedium. Ondanks het feit dat beide organismen actieve fosfatases bezitten, kan dus geen van beide Pt oxideren met een snelheid die voldoende is om de groei te ondersteunen. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) bevat mutaties die de twee gekarakteriseerde Pt-oxidatiewegen van dit organisme uitschakelen, maar die geen effect hebben op de fosfatase-expressie (9, 10). (B) BAP (E. coli alkalische fosfatase), SAP (garnalen alkalische fosfatase; Roche Applied Science, Mannheim, Duitsland) en CIP (kalfsintestinale fosfatase; Sigma) werden getest op Pt-oxidatie zoals hierboven beschreven. We gebruikten 56 ug van de aangegeven fosfatase in elke assay, wat overeenkomt met 3 BAP, 32 SAP, en 65 CIP fosfatase-eenheden, zoals gemeten door pNPP hydrolyse. Ondanks de veel hogere fosfatase-activiteiten van de eukaryote enzymen, katalyseerde alleen BAP de Pt-oxidatie in significante mate. Het gemiddelde van twee proeven is uitgezet.
Het lijkt aannemelijk dat Pt-oxidatie door BAP wordt gekatalyseerd via een mechanisme dat vergelijkbaar is met dat voor fosfaatesterhydrolyse (Fig. 4A ). Dienovereenkomstig kan Pt worden gehydrolyseerd door BAP met hydride anion als de formele vertrekkende groep. Ter ondersteuning van dit idee is een phoA mutant waarbij het actieve Ser-102 residu in alanine is veranderd niet in staat om Pt als enige P-bron te gebruiken, wat aangeeft dat dit aminozuur vereist is voor fosfaatesterhydrolyse (27) en voor Pt-oxidatie (Fig. 4B ). Hoewel directe hydride overdracht van een substraat naar een waterig proton biochemisch ongekend is, is deze reactie thermodynamisch redelijk gezien de sterke reductiepotentiaal van het fosfaat-Pt paar (E o′ = -0,650 V). De H-producerende reactie is dus vrij gunstig: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (berekend uit redoxpotentiëlen in ref. 34). Als het hydrolytische model voor Pt-oxidatie juist blijkt te zijn, zou het een zeer ongebruikelijke enzymatische reactie zijn. Studies hebben aangetoond dat BAP ook in staat is fosfodiesters (35), fosfoamiden (36), sulfaatesters (37) en thiofosfaat (38) te hydrolyseren. Deze reacties verlopen echter met snelheden die aanzienlijk langzamer zijn dan die van de Pt-hydrolysereactie, ondanks het feit dat er veel betere verlaten groepen bij betrokken zijn. Ook zijn het geen redoxreacties. De analoge reactie met hydrolyse van alkylfosfonzuren wordt niet door BAP gekatalyseerd, zoals zowel biochemisch (39) is aangetoond als door het onvermogen van Δphn-stammen om deze verbindingen als enige P-bron te gebruiken (13).
Pt-oxidatie door BAP kan plaatsvinden door middel van hydrolyse met hydride-anion als de vertrekkende groep. (A) Het chemische mechanisme voor fosfaatesterhydrolyse door BAP omvat nucleofiele aanval door een geactiveerd serineresidu (Ser-102) op de fosfaatester om een fosfoserine-enzymtussenproduct te vormen. De alkoxide verlaten groep verwerft snel een proton van oplossing om de overeenkomstige alcohol te vormen. Het lijkt waarschijnlijk dat de oxidatie van Pt plaatsvindt door middel van een soortgelijk mechanisme met het hydride anion als de vertrekkende groep. (B) De rol van Ser-102 bij Pt-oxidatie werd getest door na te gaan of een mutant met een Ser-102-Ala mutatie in het phoA-gen kon groeien op Pt-media, zoals beschreven in Fig. 1. De mutant groeide niet op Pt-media. De mutant groeide niet op Pt-medium, wat aantoont dat de actieve Ser-102 in de Pt-oxidatie nodig is. De gaststam was BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 en WM3611 dragen één-kopie integranten van de plasmiden pKY1 en pKY2, die respectievelijk het wild-type phoA-gen (phoA+) of de phoA-S102A-mutant (Ser-102-Ala) coderen.
Pt-dehydrogenase (PtxD) was het enige in vitro gekarakteriseerde enzym waarvan is aangetoond dat het Pt-oxidatie katalyseert (11). Hoewel de details van de BAP-reactie nog moeten worden opgehelderd, zijn de chemische mechanismen van de twee enzymen duidelijk verschillend. Terwijl PtxD NAD als elektronenacceptor voor de redoxreactie nodig heeft, heeft de door BAP gekatalyseerde reactie geen exogene elektronenacceptoren nodig, maar benut de grote thermodynamische drijvende kracht van de reactie om een sterk gereduceerd product (H2) uit water te produceren in een in wezen irreversibele reactie (berekende K eq = 1,1 × 108). Alle andere bekende H2-producerende reacties verlopen veel dichter bij een chemisch evenwicht en zijn meestal omkeerbaar. Bovendien bevatten alle andere bekende hydrogenasen ofwel Fe of Ni, of beide, in hun actieve sites (40). Deze observatie omvat de zogenaamde “metaal-vrije” H2-vormende methyleen tetrahydromethanopterine dehydrogenase van methanogene archaea, waarvan nu bekend is dat Fe bevatten als goed (41). BAP daarentegen bevat geen redox-actieve metalen, hoewel zowel Zn als Mg vereist zijn voor hydrolytische activiteit (27). Behandeling van BAP met chelators remt Pt-oxidatie, wat suggereert dat metalen een rol spelen in de Pt-reactie (gegevens niet weergegeven).
Ten slotte suggereren de hier gepresenteerde in vivo gegevens dat de Pt-oxidatiereactie biologisch relevant is. De waarneming dat veel bacteriën enzymen bezitten die zich toeleggen op Pt-oxidatie, toont aan dat deze eigenschap onder sterke selectieve druk staat in microbiële populaties (4, 5, 9, 42). Met dit gegeven in het achterhoofd is het interessant op te merken dat de eukaryote enzymen weliswaar veel betere fosfatasen zijn, maar niet in staat zijn tot Pt-oxidatie. Deze waarneming doet de mogelijkheid rijzen dat E. coli BAP niet geëvolueerd is om de meest efficiënte fosfatase te zijn, maar eerder om een fosfatase te zijn met het vermogen Pt te hydrolyseren. Dit idee is consistent met de merkwaardige waarneming dat E. coli BAP zeer sterk tot expressie komt (tot 6% van het totale cel-eiwit) onder fosfaat-stervatie omstandigheden (28). De traditionele verklaring voor dit verschijnsel is dat een onbekend BAP-substraat slecht gehydrolyseerd moet zijn en daarom enorme hoeveelheden enzym nodig heeft om concurrerende groeisnelheden te ondersteunen. Omdat er echter weinig verschil is in de gemeten hydrolysesnelheden voor een grote variëteit aan fosfaatestersubstraten (39, 43), lijkt het onwaarschijnlijk dat dit slechte substraat een fosfaatester zou kunnen zijn. Daarentegen is de hydrolysesnelheid van Pt aanzienlijk lager dan de hydrolysesnelheid van fosfaatesters, wat suggereert dat Pt het substraat kan zijn dat verantwoordelijk is voor het extreme expressieniveau van phoA dat wordt waargenomen in fosfaat-arme E. coli.
Het is duidelijk dat veel details van de BAP-reactie met Pt nog moeten worden opgehelderd. Verdere studie van deze unieke reactie zal waarschijnlijk niet alleen bijdragen aan ons begrip van P redox chemie en fosforyl-overdracht reacties, maar ook aan onze kennis van hydride overdracht, H2-producerende reacties, en de rol van gereduceerde P-verbindingen in de natuur.