2.19.2.3.3 Elutievoorwaarden

Efficiënte elutieoplossingen moeten idealiter de analyt-antilichaaminteracties verstoren zonder het geïmmobiliseerde Abs ongunstig te beïnvloeden. Een verdringer is een hooggeconcentreerde kruisreagerende molecule die in staat is een biospecifieke desorptie te induceren. De verdringermoleculen concurreren met de gebonden analytmoleculen, en de grote overmaat aan verdringer zorgt voor een kwantitatieve desorptie van het analyt. Voor optimale prestaties moet de verdringer aan verschillende criteria voldoen: (1) een hoge kruisreactiviteit met de geïmmobiliseerde antilichamen, 2) een retentietijd die aanzienlijk verschilt van die van de analyten omdat de grote overmaat een opvallende piek veroorzaakt die de detectie van de analyten gemakkelijk kan storen, 3) een goede stabiliteit en een hoge zuiverheid omdat verontreinigingen van niet meer dan 0,01-0,1% het chromatogram kunnen verstoren, en 4) een lage prijs, niet-giftige eigenschappen, afwezigheid in echte monsters en een lage detecteerbaarheid in vergelijking met de analyten. Bovendien is een groot volume elutievloeistof nodig, wat reconcentratie op een klassieke SPE-drager vóór de analyse noodzakelijk maakt. Daarom wordt de voorkeur gegeven aan elutiecondities die de volledige terugwinning van de doelanalyt met een klein elutievolume mogelijk maken.

Chaotrope ionen worden algemeen gebruikt voor de elutie van grote moleculen zoals eiwitten. Deze ionen verstoren de waterstructuur rond grote moleculen, d.w.z. antilichamen en doelmoleculen, waardoor de hydrofobe interacties in grote molecuulstructuren en tussen de analyt en het antilichaam worden verbroken. De meest voorkomende chaotrope ionen zijn chloride-, jodide-, perchloraat- en thiocyanaat-ionen, bij concentraties tussen 1,5 en 8 mol l-1. De verschillende waterige oplossingen die met succes kunnen worden toegepast voor de desorptie van eiwitten uit IS bleken echter niet in staat te zijn kleine moleculen te desorberen. De desorptie van het eiwit berust waarschijnlijk voornamelijk op veranderingen in de structuur van het gebonden eiwit (gedeeltelijke denaturatie), en niet op veranderingen in de structuur van de geïmmobiliseerde antilichamen. Voor de elutie van de kleine moleculen, die niet gevoelig zijn voor denaturatie, zijn dus veel strengere voorwaarden nodig. Bovendien kan bij een temperatuurverhoging van 4 tot 43 °C de dissociatieconstante van de antilichaam-anilichaam-interacties met twee orden van grootte worden verhoogd. Deze methode is niet doeltreffend genoeg om te worden toegepast op de elutie van kleine moleculen. Elutie met lage pH-oplossingen wordt vaak uitgevoerd om kleine moleculen uit IS te desorberen, maar daarvoor zijn drie pH-eenheden van het isoëlektrische punt van het antilichaam nodig. Bij deze vorm van elutie (verschuiving van de pH zonder wijziging van de ionensterkte) wordt voorkomen dat labiele antilichamen worden beschadigd. Een ongemak is dat nog steeds grote volumes nodig zijn voor volledige desorptie, waardoor de aan de extractieprocedures verbonden verrijkingsfactoren afnemen.

Een efficiënte elutie van kleine moleculen uit een IS kan worden bereikt met een kleiner volume van een water-organisch modificatormengsel. Figuur 6 geeft als voorbeeld het elutieprofiel van twee herbiciden, isoproturon en atrazine, na de percolatie van een met elk analyt verrijkt watermonster op de overeenkomstige IS. Verscheidene elutievloeistoffen (methanol, ethanol en ACN) vermengd met water werden geëvalueerd.

Figuur 6. Elutieprofielen van atrazine, isoproturon, 2,4,6-trichloorfenol en pentachloorfenol uit hun overeenkomstige IS met elutieoplossingen die toenemende hoeveelheden van een organisch oplosmiddel bevatten in aangezuurd of niet-aangezuurd water na de percolatie van watermonsters waaraan elk analyt is toegevoegd. ACN, acetonitril; MeOH, methanol; EtOH, ethanol; AA, azijnzuur; TFA, trifluorazijnzuur.

De resulterende elutieprofielen hangen sterk af van de aard van het oplosmiddel. De drie geteste oplosmiddelen maken een volledige elutie van beide analyten mogelijk. ACN vertoont echter de hoogste elutiekracht: het laagste gehalte van dit oplosmiddel levert een volledige elutie van beide analyten op. Een ACN-gehalte van 40% en 60% is voldoende om respectievelijk isoproturon en atrazine terug te winnen, terwijl 60% en 80% methanol nodig is. In dit geval lijkt de elutiekracht van het oplosmiddel verband te houden met de hydrofobe aard ervan, waarbij ACN (Hildebrand-oplosbaarheidsparameter δ = 24,3 MPa1/2) minder polair is dan ethanol (δ = 26,0 MPa1/2) en methanol (δ = 29,7 MPa1/2). Deze resultaten lijken erop te wijzen dat de interacties tussen de herbiciden en hun corresponderende antilichamen voornamelijk hydrofoob van aard zijn. De aanwezigheid van apolaire oplosmiddelen vermindert de hydrofobe bindingscomponent van de antilichaam-analiet interactie. Het beïnvloedt echter ook de stabiliteit van de hydrofobe bindingen, waardoor de tertiaire structuur van het antilichaam behouden blijft, en resulteert in het vrijkomen van het antigeen. Uit deze voorbeelden van de elutie van atrazine of isoproturon uit de overeenkomstige IS blijkt dat een efficiënte elutie wordt verkregen door rechtstreeks een grote hoeveelheid methanol of ACN, 70-80%, aan de elutiefractie toe te voegen. Met deze grote hoeveelheid organische modificator kan het volume van de elutiefractie zo klein mogelijk worden gehouden, zodat de analyt in het eluaat kan worden geconcentreerd. Er moet op worden gelet dat de keuze van de bindingswijze verenigbaar is met deze elutieomstandigheden. Door het gebruik van niet-covalente binding is het niet mogelijk een zo grote hoeveelheid modificator toe te passen zonder het risico te lopen dat de binding van de antilichamen aan het sorptiemiddel wordt verstoord. Het gebruik van een sol-gel proces voor de immobilisatie van antilichamen beperkt ook de mogelijkheid om een grote hoeveelheid organisch oplosmiddel te gebruiken. Aangetoond is dat een grote hoeveelheid organische modificator, zoals antilichamen, het uitlogen van antilichamen uit de sol-gel matrix veroorzaakt.8

Een combinatie van organisch oplosmiddel en organisch zuur is soms vereist. Figuur 6 toont ook het elutieprofiel van 2,4,6-trichorfenol en pentachloorfenol uit een antipentachloorfenol-IS met gebruikmaking van een hydro-organisch mengsel met en zonder toevoeging van een zuur aan de elutievloeistof. Trichloorfenol kon volledig worden teruggewonnen met behulp van water/ACN (20:80, v/v) of water/ACN (30:70, v/v) aangezuurd op pH 3 met behulp van trifluorazijnzuur (TFA). Bij aanzuring met 1% (v/v) azijnzuur (AA) was een mengsel met slechts 30% ACN effectief voor de elutie. Daarentegen was de elutie van pentachloorfenol, dat een hogere affiniteit voor de PAbs heeft dan trichloorfenol, onmogelijk met zuiver ACN of met ACN aangezuurd met TFA. De desorptie kon alleen worden bereikt met water/ACN 20:80 (v/v) dat 1% AA (v/v) bevat.

Daarom wordt in de meeste off-line procedures, inclusief die welke worden aanbevolen met commerciële IS’s voor eenmalig gebruik, desorptie bereikt met een hoog percentage van een organisch oplosmiddel, soms bij lage pH.

Concluderend kan worden gesteld dat de keuze van de elutiecondities in de eerste plaats afhangt van de affiniteit tussen de antilichamen en de analyten. Zij hangt ook af van de aard van de analyt, wegens de verhouding tussen elektronische en hydrofobe interacties die bij de antigeen-antilichaam interacties betrokken zijn. Tenslotte hangt het af van de immobilisatiestrategie van de antilichamen; niet-covalente binding voorkomt het gebruik van grote hoeveelheden organische oplosmiddelen.