Invasion Assay

Materialen:

Falcon 24 wells weefselkweekplaat

Falcon Cell Culture Insert:8μm poriegrootte, 24 wells formaat

Cat# 3097

Matrigel (verdund inDMEM/F12)

5% Glutaraldehyde in 1XPBS

0.5% Toluidine Blauw in 2% Na2CO3

Voorbereiding van Boyden Kamer:

1. Met behulp van steriele tang verwijderen celwand inserts uit hun verpakking en pit ze in putjes van een 24 wells plaat.
2. Was inserts 2 keer met 300 ul DMEM / F12

(Wees voorzichtig niet te steken in het membraan)

1. Add 20μl van 1:6 verdund Matrigel (2-3 mg / ml eiwit) naar het midden van elke cel goed inserts. Voorzichtig verspreid de Matrigel over het gehele oppervlak van het membraan.
2. Plaats beklede inserts in incubator om de Matrigel te stollen gedurende 20-30 min.

Voorbereiding van cellen voor Assay:

1. Behandel en groei cellen volgens de experimentele conditie. Het kan wenselijk zijn cellen te synchroniseren tot dezelfde groeitoestand.
2. Trypsineren en tellen van cellen
3. Verwijder trypsine en resuspendeer met vers medium.
4. Plaat 1X105 cellen in 200 ul van gedefinieerde medium in de bovenste kamer.
5. Voeg 300 ul van medium onderste kamer.
6. Kweek gedurende ongeveer 20 uur.

De tijd varieert voor verschillende cellijnen en kan oplopen tot 48 uur voor minder invasieve cellen.

Fixatie en kleuring:

1. Na de cultuur, aspirate medium uit onderste kamer
2. Voeg 0,5 ml van 5% glutaaraldehyde in 1XPBS, incubeer gedurende 10 min. @ R.T
3. Ventil de glutaaraldehydeoplossing, was elke well 3 keer met D.W
4. Voeg 0,5 ml 0,5% Toluidineblauwe kleuroplossing toe in de onderste kamer, incubeer gedurende 10-20 min @ R.T
5. Ventil de oplossing uit zowel de bovenste als de onderste kamer, was de onderste kamer 3 keer met D.W
6. Veeg de binnenkant van de bovenste kamer voorzichtig af met een wattenstaafje. (Druk niet te hard, want dan kan het membraan loslaten.) Binnengedrongen cellen bevinden zich in het midden van de onderkant van het membraan.
7. Tel het aantal cellen met q 20X objectief van microscoop. Tel ten minste 3 velden per membraan.