Abstract
Achtergrond. Amyloïdose is een extracellulaire neerslag van eosinofiel hyalien materiaal van eigen oorsprong met bijzondere kleuringseigenschappen en een fibrillaire ultrastructuur. Maculaire amyloïdose is beperkt tot de huid, en verschillende factoren zijn voorgesteld voor de pathogenese ervan. Detectie van Epstein-Barr virus (EBV) DNA in deze laesie suggereert dat dit virus een rol kan spelen in de pathogenese van deze ziekte. Doelstelling. EBV DNA werd gedetecteerd in 30 huidstalen met een diagnose van maculaire amyloïdose en 31 gezonde huidstalen in de marge van verwijderde melanocytaire nevi door gebruik te maken van PCR. Resultaten. Bij patiënten die positief waren voor het beta-globine gen in PCR, was het BLLF1 gen van het EBV virus positief bij 23 patiënten (8 patiënten in de casus en 15 patiënten in de controlegroep). Er was geen significant verschil in aanwezigheid van EBV DNA tussen maculaire amyloïdose (3,8%) en controle (23,8%) groepen (). Conclusie. De bevindingen van deze studie toonden aan dat EBV niet betrokken is bij de pathogenese van maculaire amyloïdose.
1. Inleiding
Amyloïdose is de extracellulaire afzetting van een groep vezelige eiwitten. Er zijn verschillende benaderingen voor de classificatie van amyloïdose, maar de eenvoudigste methode is een indeling in systemische en orgaanspecifieke (gelokaliseerde) typen. Bij beide typen is de huid een betrokken weefsel. Cutane gelokaliseerde amyloïdose is van twee typen: (i) keratinisch, dat primair of secundair kan zijn, en (ii) nodulair. Het secundaire type is secundair aan andere huidlaesies zoals huidtumoren, inflammatoire huidaandoeningen en fototherapie. Er zijn twee typen keratotische amyloïdose geïdentificeerd: maculaire en lichen amyloïdose, en de laatste komt vaker voor. Bij keratotische amyloïdose zijn de keratineafzettingen afkomstig van basale keratinocyten voornamelijk CK5-positief. Het keratotische type wordt vooral waargenomen in Zuidoost-Azië, Zuid-Amerika en China. Het kent familiaire (10%) en sporadische vormen, en de laatste komt vaker voor bij vrouwen. De meest voorkomende plaatsen van betrokkenheid zijn de bovenrug (interscapular gebied) en extremiteiten (scheenbenen en armen), hoewel ze ook zijn beschreven op gezicht, romp en dijen. Maculaire amyloïdose laesies verschijnen meestal in de vorm van hypergepigmenteerde vlekken met onbepaalde marges samengesteld uit grijsbruine macules, vaak met een gereticuleerd of gerimpeld uiterlijk (figuur 1). Jeuk is een veel voorkomend symptoom vóór het begin van amyloïdose .
De pathogenese van deze aandoening is niet volledig opgehelderd, behalve dat het afgezette keratine afkomstig is van keratinocyten . Twee pathogene mechanismen zijn voorgesteld, waaronder de apoptotische (fibrillaire) theorie en de secretoire theorie. Volgens de apoptotische theorie wordt de degeneratie van beschadigde keratinocyten in de basale laag gevolgd door de omzetting van deze colloïde lichaampjes door histiocyten en fibroblasten in de papillaire dermis in amyloïd (figuur 2). Volgens de secretoire theorie verspreiden amyloïde afzettingen afkomstig van gedegenereerde basale keratinocyten zich via de beschadigde lamina densa naar de papillaire dermis. Er zijn verschillende etiologische factoren betrokken bij de pathogenese van maculaire amyloïdose: raciale factoren, genetische predispositie, omgevingsfactoren, geslacht (vrouwelijk), vrouwelijke hormonen, blootstelling aan zonlicht, wrijving (langdurige slijtage), atopie, auto-immuniteit (gebaseerd op associatie met systemische lupus erythematosus, dermatomyositis, systemische sclerose, sarcoïdose, en IgA-nefropathie) , en infectie met EBV . EBV, waarvan de aanwezigheid is gerapporteerd in de epidermis van maculaire amyloïdose, werkt waarschijnlijk als een factor die bijdraagt aan de degeneratie van keratinocyten .
De rol van EBV in de etiopathogenese van primaire cutane amyloïdose is slechts in twee eerdere studies geëvalueerd, waaronder een enkel case report en een case series van 27 patiënten uit China . Gezien het gebrek aan studies over het verband tussen EBV en maculaire amyloïdose, hebben wij besloten een studie hiernaar uit te voeren in Iran. Misschien kunnen antivirale middelen in de toekomst gebruikt worden voor de behandeling van deze ziekte in geval van associatie met EBV.
2. Materialen en Methoden
In deze case-control studie werden 38 maculaire amyloïdose monsters en 38 gezonde huid monsters rond geëxcideerde melanocytaire nevi van leeftijd- en geslacht gematchte patiënten zonder maculaire amyloïdose opgenomen in het klinisch onderzoek op basis van een niet-willekeurige objectief-georiënteerde steekproeftrekking. Inclusiecriteria waren paraffineblokken met voldoende weefsel in de archieven van de afdeling Pathologie van het Imam Reza Ziekenhuis in Mashhad, gediagnosticeerd met maculaire amyloïdose op basis van pathologisch verslag en klinische presentatie. Exclusiecriteria waren onder meer blokken met onvolmaakte gegevens in de archieven en onvoldoende monsters voor PCR.
In de casusgroep werd de amyloïdafzetting bevestigd door optische microscopie en Congo rood kleuring. In de volgende stap werden zes 5 urn secties bereid uit elk van de blokken in het geval en controlegroepen in steriele omstandigheden met behulp van steriele mes en werden geplaatst in steriele Eppendorf buizen.
2.1. Deparaffineren
Xylol/ethanol werd gebruikt om de geparaffineerde weefsels te deparaffineren. Eén ml xylol werd aan de microbuisjes met de weefselcoupes toegevoegd en bij kamertemperatuur gedurende een half uur onder voortdurend schudden geïncubeerd. In de volgende stap werden de microbuisjes gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten, waarna het supernatant werd weggegooid. Deze twee stappen werden eenmaal herhaald. Vijfhonderd ul 100% ethanol werd aan het neerslag toegevoegd en na enkele keren omkeren van de microbuisjes gedurende 10 m in 13.000 rpm gecentrifugeerd, waarna het supernatans werd verwijderd. Deze stap werd nogmaals herhaald. Tenslotte werd het resulterende neerslag op kamertemperatuur gebracht om ethanol volledig te laten verdampen, maar niet het neerslag.
2.2. DNA-extractie
DNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van BIO BASIC INC (Canada) kit met lotnummer 8401-140116. Voor de extractie werd lysisbuffer-T gebruikt. In de volgende stap werden 100 μl extractiebuffer en 10 μl proteinase K aan elk microbuisje toegevoegd en gemengd. Weefselmonsters werden aan het mengsel toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens werden de monsters gedurende 3 minuten bij 95 °C geïncubeerd om proteinase K te inactiveren. Honderd μl Universal Buffer NST werd aan de buisjes toegevoegd en 10 keer omgedraaid. Het verkregen mengsel werd gebruikt voor PCR.
2.3. PCR
In deze studie werd PCR gebruikt om de aanwezigheid van EBV-genoom in maculaire amyloïdose op te sporen. Na DNA-extractie uit geparaffineerde blokken werd de kwaliteit van het DNA uit weefsels met paraffine-embedding bepaald met behulp van primers voor het beta-globine gen. GH20 en PC04 beta-globine gen primers gebruikt in deze studie amplificeerden een 260 bp fragment. De volgorde van deze primers was als volgt: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′. De monsters die met de gewenste primers een 260 bp fragment produceerden werden gunstig bevonden voor amplificatie van EBV virus BLLF1 gen.
Aanwezigheid van EBV sequentie in de geëxtraheerde DNA monsters werd getest met Cinna Gen kit met lotnummer 935701 (Sina Clon, Iran). Deze kit is ontworpen om de kwaliteit van EBV DNA in geïnfecteerde monsters te bepalen met behulp van PCR. Geoptimaliseerde 1x PCR als mengsel van recombinant Taq DNA-polymerase, PCR-buffer, MgCl2, dNTPs, en primers was het reagens dat voor het mengen werd gebruikt. De zeer specifieke en repetitieve regio van het BLLF1-gen dat codeert voor gp 350/220 wordt door primers geamplificeerd. Zij kunnen ten minste 30 kopieën van EBV opsporen. De aanwezigheid van 239 bp of 256 bp fragmenten duidt op een positief testresultaat.
Data-analyse werd uitgevoerd met SPSS 11.5 software. Grafieken en statistische tabellen werden gebruikt om gegevens te beschrijven en Chi-kwadraat en onafhankelijke -testen werden gebruikt om EBV te vergelijken in gezonde en patiënten monsters. Bij alle testen werd een significantieniveau van 0.05 aangehouden.
3. Resultaten
Vijftig procent van de patiënten was man (19/38) en 50% was vrouw (19/38). Drie patiënten waren in de leeftijdsgroep jonger dan 20 jaar (7,9%), 5 patiënten 20-30 jaar (13,2%), 10 patiënten 30-40 jaar (26,3%), 13 patiënten 40-50 jaar (34,2%), 4 patiënten 50-60 jaar (10,5%), en 3 patiënten ouder dan 60 jaar (7,9%). De minimum- en maximumleeftijd waren respectievelijk 19 en 76 jaar. Er waren 27 gevallen van infectie in de romp (71,1%) en 11 gevallen in de extremiteiten (28,9%). De studie- en controlegroep waren gematcht voor leeftijd () en geslacht ().
PCR werd uitgevoerd voor beta-globine gen in 76 monsters (38 gevallen en 38 controles), die positief was in 61 monsters (30 monsters in de casusgroep en 31 in de controlegroep) en negatief was in 15 monsters (8 monsters in de casusgroep en 7 in de controlegroep) (figuur 3).
In 61 monsters die positief waren voor het beta-globine gen in PCR, was het BLLF1 gen van EBV positief in 23 gevallen (8 gevallen in de onderzoeksgroep en 15 gevallen in de controlegroep) en negatief in 38 gevallen (22 gevallen in de onderzoeksgroep en 16 gevallen in de controlegroep) (figuur 4).
PCR van BLLF1-gen van EBV was 26,7% positief in de onderzoeksgroep en 48,4% positief in de controlegroep. Chi-kwadraat testresultaten toonden geen correlatie aan tussen EBV en maculaire amyloïdose () (Tabel 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discussie
Amyloïdose is bekend als extracellulaire afzetting van eosinofiel hyalien materiaal van eigen oorsprong met specifieke kleuring en ultrastructurele kenmerken. Deze aandoening kan voorkomen op de achtergrond van systemische ziekten of kan beperkt blijven tot de huid. Maculaire amyloïdose blijft beperkt tot de huid. EBV kan de afscheiding van amyloïd materiaal door keratinocyten stimuleren of kan een stimulans zijn voor de degeneratie van keratinocyten en de omzetting van gedegenereerde keratinocytaire filamenten in amyloïd . Recente studies hebben de rol van epitheelcellen bij de voortplanting van EBV aangetoond. EBV-receptoren op het celoppervlak, aangetroffen in minder gedifferentieerd plaveiselepitheel, suggereren een directe infectie van epidermale keratinocyten. Infectie kan ook optreden in kiemlagen; virusreplicatie is echter alleen mogelijk door rijping en differentiatie van de cellen. De expressie van cytokeratine in menselijke keratinocyten verandert in vitro na infectie met EBV, wat resulteert in hun omzetting in fibroblasten. Fibroblasten kunnen keratine-aggregaten fagocytiseren en omzetten in amyloïd.
Drago et al. toonden deze correlatie aan in Italië in 1996. Hun patiënte was een 30-jarige vrouw met een tienjarige geschiedenis van jeukende bruine papels en macules op de borst en rug met symptomen van chronisch vermoeidheidssyndroom. Zij konden EBV-genoom aantonen in epidermale laesies met behulp van in situ hybridisatietechniek. Het EBV-genoom werd voornamelijk aangetoond in de basale epidermale cellen en in de cellen van de hogere lagen, vooral in het cytoplasma. Serologische tests voor EBV waren ook positief bij de patiënt. Antivirale therapie met acyclovir en interferon alfa verbeterde de huidlaesies en de algemene symptomen bij de patiënt. Een andere studie werd uitgevoerd door Chang et al. op huidweefsel van 27 patiënten met een diagnose van lichen en maculaire amyloïdose in Taiwan in 1997. In situ hybridisatie methode toonde EBV DNA aan in laesies van 11 patiënten (40.7%), terwijl in de controlegroep (waaronder drie patiënten met secundaire cutane amyloïdose, twee patiënten met primaire systemische amyloïdose, en vier patiënten met chronische simplex lichen) EBV DNA ontbrak .
Volgens deze studie was er geen correlatie tussen EBV en maculaire amyloïdose (). EBV DNA was aanwezig in 8 patiënten met maculaire amyloïdose en 15 controles in onze studie. Het verschil in detectiegraad van EBV DNA tussen maculaire amyloïdose patiënten en controles in deze studie met de genoemde studies kan te wijten zijn aan de volgende redenen:(1)Gebrek aan associatie tussen maculaire amyloïdose en EBV infectie: er zijn een paar studies die onvoldoende bewijs leveren voor een definitieve correlatie tussen EBV en maculaire amyloïdose, dus op basis van de resultaten van onze studie konden we deze conclusie trekken.(2)Methodologie (PCR versus in situ hybridisatie): we gebruikten een gevoelige methode voor detectie van EBV DNA met positieve en negatieve controles. Gebaseerd op eerdere studies, is PCR even gevoelig als in situ hybridisatie. Aangezien wij echter geen in situ hybridisatie gebruikten, konden wij de exacte geïnfecteerde cel met EBV niet lokaliseren in onze controles, die mogelijk de circulerende B-cellen van de huid zijn in plaats van keratinocyten. Aangezien wij positieve en negatieve controles gebruikten in onze PCR kit voor EBV, konden de positieve gevallen in onze controlegroep geen vals-positieve zijn.(3)Controles: de controles in onze studie waren de gezonde huid rond melanocytaire nevi, maar de controles in de studie van Chang waren andere cutane aandoeningen.(4)Type cutane amyloïdose: in onze studie hadden alle patiënten maculaire amyloïdose, maar in de beide eerdere studies waren de meeste patiënten lichen amyloïdose.
5. Conclusie
Volgens de resultaten van deze studie, was er geen correlatie tussen EBV en maculaire amyloïdose. Wij bevelen het gebruik van vers weefsel of snel ingevroren biopsie punch aan, alsmede gelijktijdige serologische studie van patiënten op anti-EBV antilichaam om meer accurate resultaten te verkrijgen voor vergelijkende studie van EBV DNA in maculaire amyloïdose. In situ PCR kan ook worden gebruikt om de EBV DNA-positieve cellen in de monsters te lokaliseren. Andere genen kunnen worden gebruikt om EBV in het weefsel op te sporen omdat sommige EBV monsters gemuteerd zijn voor het in deze studie gebruikte BLLF1 gen.
Ook bevelen wij aan een vergelijkende studie uit te voeren naar de detectie van EBV in zowel de betrokken als de niet betrokken huid van de patiënten met maculaire amyloïdose.
Conflict of Interests
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
De auteurs uiten hun diepe dankbaarheid voor onderzoek adjunct van MUMS voor financiële steun en goedkeuring van het onderzoeksvoorstel (nr. 911283) met betrekking tot het proefschrift van Narges Nazeri. Financiële steun door onderzoek adjunct van de Mashhad Universiteit voor Medische Wetenschappen wordt erkend.