Moleculair klonen is een reeks technieken die worden gebruikt om recombinant DNA van een prokaryotische of eukaryotische bron in te brengen in een replicerend medium zoals plasmiden of virale vectoren. Klonen verwijst naar het maken van talrijke kopieën van een DNA-fragment van belang, zoals een gen. In deze video leert u over de verschillende stappen van moleculair klonen, hoe de procedure moet worden opgezet, en verschillende toepassingen van deze techniek.
Er zijn ten minste twee belangrijke DNA-moleculen nodig voordat het klonen begint. Ten eerste, en dat is het belangrijkste, heb je het DNA-fragment nodig dat je gaat klonen, ook wel bekend als de insert. Het kan afkomstig zijn van een prokaryoot, eukaryoot, een uitgestorven organisme, of het kan kunstmatig in het laboratorium worden gemaakt. Door moleculair klonen kunnen we meer te weten komen over de functie van een bepaald gen.
Ten tweede heb je een vector nodig. Een vector is plasmide-DNA dat in de moleculaire biologie wordt gebruikt om van een bepaald gen meer kopieën te maken of een eiwit te produceren. Plasmiden zijn een voorbeeld van een vector, en zijn circulair, extra chromosomaal, DNA dat door bacteriën wordt gerepliceerd.
Een plasmide heeft meestal een meervoudige kloneringsplaats of MCS, dit gebied bevat herkenningsplaatsen voor verschillende restrictie-endonucleasen ook bekend als restrictie-enzymen. Verschillende inserts kunnen in het plasmide worden ingebouwd door middel van een techniek die ligatie wordt genoemd. De plasmidevector bevat ook een replicatieoorsprong, waardoor hij in bacteriën kan worden gerepliceerd. Bovendien bevat het plasmide een antibiotica-gen. Als bacteriën het plasmide opnemen, zullen zij overleven in media die het antibioticum bevatten. Dit maakt de selectie mogelijk van bacteriën die met succes zijn getransformeerd.
De insert en de vector worden gekloond in een gastheerorganisme; het meest gebruikte bij moleculair klonen is E. coli. E. coli groeit snel, is overal verkrijgbaar en er worden talrijke verschillende kloneringsvectoren in de handel gebracht. Eukaryoten, zoals gist, kunnen ook worden gebruikt als gastheerorganisme voor vectoren.
De eerste stap van de algemene moleculaire kloneringsprocedure is het verkrijgen van het gewenste insert, dat kan worden afgeleid van DNA of mRNA van elk celtype. De optimale vector en het gastheerorganisme worden dan gekozen op basis van het type insert en wat er uiteindelijk mee zal worden gedaan. Voor de replicatie van het insert wordt vaak gebruik gemaakt van een polymerasekettingreactie of PCR-methode.
Daarna worden met behulp van een reeks enzymatische reacties het insert en de digest samengevoegd en in het gastheerorganisme gebracht voor massale replicatie. De gerepliceerde vectoren worden gezuiverd van bacteriën en na restrictiedigestie geanalyseerd op een gel. De door gel gezuiverde fragmenten worden later opgestuurd voor sequentiebepaling om te verifiëren dat de inzet het gewenste DNA-fragment is.
Laten we eens wat gedetailleerder kijken naar hoe moleculair klonen wordt uitgevoerd. Voordat u begint, moet u uw kloneringsstrategie uitstippelen, voordat u een poging tot kloneren op de werkbank doet. Elke plasmide-vector bijvoorbeeld biedt een eindig aantal restrictieplaatsen om de insertie via de meervoudige kloneringsplaats te integreren. U zult restrictieplaatsen moeten kiezen die niet in uw insert voorkomen, zodat u het niet doorklieft. Het kan zijn dat je gedwongen bent om een fragment met een stomp uiteinde te verbinden met een fragment met een overhang. Als dat het geval is, dan is het gebruik van het klenow fragment om een stomp eind ligatie op te zetten misschien de enige optie om het insert in de gewenste vector te krijgen. Inzicht in de verschillende moleculaire kloneringshulpmiddelen die tot uw beschikking staan, evenals het bedenken van een zorgvuldige strategie voordat u begint met klonen, kan een enorme tijdsbesparing opleveren.
De bron van DNA voor moleculair kloneren kan met eenvoudige extractietechnieken uit vrijwel elk type cel of weefselmonster worden geïsoleerd. Eenmaal geïsoleerd kan PCR worden gebruikt om de insert te amplificeren.
Als de insert eenmaal is geamplificeerd, worden zowel de insert als de vector gedigesteerd door restrictie-enzymen, ook wel restrictie-endonucleasen genoemd.
Als de insert eenmaal is gedigesteerd, kunnen de insert en de vector op een gel worden gelegd en gezuiverd door middel van een proces dat gelzuivering wordt genoemd. Met betrekking tot de vector zal deze stap helpen om gelineariseerde plasmide te zuiveren van ongesneden plasmide, die de neiging heeft om te verschijnen als een hoog moleculair gewicht uitstrijkje op een gel.
Na gel zuivering van de digests, wordt de insert geligeerd of verbonden met de plasmide, via een enzym genaamd DNA-ligase.
In het algemeen is het altijd een goed idee om ligaties zo op te zetten dat de verhouding tussen insert en vector 3:1 is, zodat slechts een kleine hoeveelheid vector zelf-ligeert. Zodra de ligatie is opgezet op ijs, wordt het geïncubeerd ergens tussen 14-25 ˚C van 1 uur tot ’s nachts.
Volgende, transformatie wordt uitgevoerd om de plasmide vector te introduceren in de gastheer die het zal repliceren.
Na de transformatie worden bacteriën uitgeplaat op agarplaten met antibioticum en ’s nachts geïncubeerd bij 37°C. Omdat de plasimide een antibioticaresistentiegen bevat, zal een geslaagde transformatie bacteriekolonies opleveren wanneer deze op agarplaten in aanwezigheid van antibiotica worden gekweekt. Afzonderlijke kolonies kunnen vervolgens van de getransformeerde plaat worden geplukt, in genummerde buisjes in vloeibare groeimedia worden geplaatst en in een schuddende incubator worden gezet om uit te breiden. Een klein volume van de vloeibare cultuur wordt toegevoegd aan een genummerde agarplaat, terwijl de rest van de cultuur verder gaat met de plasmidezuivering. Het nummeringsschema dat de identiteit aangeeft van de bacteriekolonies waaruit uiteindelijk de plasmiden zullen worden gezuiverd, wordt gedurende het hele plasmidezuiveringsproces gehandhaafd.
Een monster van het gezuiverde plasmide wordt vervolgens met restrictie-enzymen versneden. De digest wordt vervolgens geladen en op de gel uitgevoerd om te controleren op de aanwezigheid van insert, waarmee wordt geverifieerd dat de bacteriekolonie werd getransformeerd met een plasmide dat een insert bevat en niet met een zelfgeligeerd plasmide. Bacteriën waarvan is vastgesteld dat zij met een insert-bevattend plasmide zijn getransformeerd, worden geëxpandeerd voor verdere plasmidezuivering. Sequencing wordt gebruikt als een laatste verificatiestap om te bevestigen dat uw gen van belang is gekloond.
Moleculair klonen kan worden gebruikt voor een bijna onbeperkt aantal toepassingen. Bijvoorbeeld, wanneer een mRNA-sjabloon wordt omgekeerd getranscribeerd tot cDNA, of complementair DNA, door een enzym dat omgekeerde transcriptase wordt genoemd en vervolgens PCR wordt gebruikt om het cDNA te amplificeren, kan moleculair klonen worden gebruikt om een cDNA-bibliotheek te maken – een bibliotheek van alle genen die door een bepaald celtype tot expressie worden gebracht.
Moleculair klonen kan ook worden gebruikt om een reeks genen of een gencluster van een bacteriestam te nemen en deze te reorganiseren in plasmiden die in een andere stam worden getransformeerd, zodat een volledige biosynthetische route kan worden gereconstrueerd om een complex molecuul te produceren.
Met moleculair klonen kan een mutantbibliotheek worden gegenereerd door een doelplasmide tot expressie te brengen in een speciale bacteriestam die een foutgevoelige polymerase gebruikt wanneer hij bij bepaalde temperaturen wordt gekweekt. De mutaties kunnen door sequencing worden gekarakteriseerd. Bacteriën getransformeerd met mutantgenen kunnen vervolgens worden getest met verschillende geneesmiddelen of chemicaliën om te zien welke bacteriekolonies zijn geëvolueerd om geneesmiddelenresistentie te hebben.
Dankzij moleculair klonen kunnen reportergenen in DNA-plasmiden worden ingebouwd; een gangbaar reportergen is groen fluorescent eiwit of GFP, dat een groene fluorescentie afgeeft wanneer het aan UV-licht wordt blootgesteld. Een reporter gen kan ook worden ingevoegd in een alfavirus om infectie in muggen en overdraagbaarheid in cellen aan te tonen.
Je hebt zojuist JoVEs video over moleculair klonen bekeken. Je zou nu moeten begrijpen hoe moleculair klonen werkt en hoe de techniek kan worden gebruikt in de moleculaire biologie. Zoals altijd, bedankt voor het kijken.