Natriumazide induceert mitochondriaal-gemedieerde apoptose in PC12 cellen via een Pgc-1α-geassocieerde signaalroute

Introduction

Als een wit, kleurloos en kristallijn poeder wordt natriumazide (NaN3) geclassificeerd als een zeer giftige stof. De toxische effecten zijn vergelijkbaar met die van cyanide, en het verwondt het zenuwstelsel en het cardiovasculaire systeem, de ogen en de huid. Dit toxische element wordt snel actief na inname en de belangrijkste effecten treden enkele uren na orale inname op, afhankelijk van de ingenomen hoeveelheid (1,2). Blootstelling aan NaN3 kan binnen enkele minuten een aantal symptomen veroorzaken, waaronder misselijkheid, braken, hoofdpijn, rusteloosheid, duizeligheid, zwakte, snelle ademhaling en een snelle hartslag (3). Hoge hoeveelheden van dit toxische element veroorzaken onmiddellijk stuiptrekkingen, bewustzijnsverlies, lage hartslag en bloeddruk, en ademhalingsstilstand, wat uiteindelijk tot de dood leidt (3). Onder de aangetoonde werkingsmechanismen van NaN3, is de meest relevante de remming van het cytochroomoxidase-ademhalingsketencomplex (4). Eerdere studies hebben aangetoond dat NaN3, een remmer van complex IV (Cox IV),apoptose kan induceren in primaire corticale neuronen, die caspase-3 afhankelijk is en geassocieerd is met het vrijkomen van cytochroom c (5).

In de mitochondriale biosynthese kan de promotor van respiratoire keten Cox IV geactiveerd worden door nucleaire respiratoirefactoren (Nrf)-1/2. Tegelijkertijd kan Nrf worden aangepast door het reguleren van de activiteit van genen die coderen voor mitochondriale transcriptiefactor A (Tfam) om indirect de expressieniveaus van respiratoire ketengenen te reguleren. Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) en andere co-activatoren vormen de Pgc-1α signaalcascade, die een centrale rol speelt in een regulerend netwerk dat de transcriptionele controle vanmitochondriale biogenese en respiratoire functie regelt. In deze signaalcascade activeert Pgc-1α eerst Nrf-1/2 in plaats van zich rechtstreeks aan het mitochondriaal DNA te binden, en Nrf-1/2 induceert de activering van Tfam in combinatie met de promoter van Tfam en brengt de transcriptie en replicatie van mitochondriaal DNA op gang, wat leidt tot verhoogde expressieniveaus van mitochondriale eiwitten(6). Tegelijkertijd kan Pgc-1α worden geactiveerd door CaN-, Ca2+/calmoduline-afhankelijke proteinkinase (CaMK)-, mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK)- en cycline-afhankelijke kinase-gemedieerde signaalwegen (7). In de huidige studie werden PC12 cellen gebruikt om een dopamine neuron model te genereren, en de effecten en het mechanisme van NaN3 op de Pgc-1α-geassocieerde paden in PC12 cellen werden onderzocht, om te identificeren of NaN3 toxiciteit in gekweekte PC12 cellen induceert en de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij deze effecten.

Materialen en methoden

Materialen

Ratten feochromocytoom PC12 cellen werden gekocht van de Celbank van Type Culture Collection van de Chinese Academy ofSciences (Shanghai, China). Stockoplossing van NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) werd opgelost in de steriele zoutoplossing tot een 1 M stockoplossing te maken, die vervolgens werd verdund tot de gewenste concentraties voorafgaand aan de experimenten. Een eenstaps TUNEL-apoptosebepalingskit (C1090), Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) apoptose-opsporingskit (C1063), verbeterde adenosine-5′-trifosfaat (ATP)-bepalingskit (S0027), JC-1 Mitochondriaal Membraan Potentiaal Assay kit (C2006) en Reactieve Zuurstof Species Assay kit (S0033) werden geleverd door Beyotime Instituut voor Biotechnologie (Haimen, China).

Celkweek en levensvatbaarheidstest

PC12-cellen werden bewaard in Dulbecco’s gemodificeerd adelaarsmedium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, VS), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) en 1% antibiotica-antimycoticumoplossing bestaande uit 10.000 U penicilline en 10.000 U streptomycine. De cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 en altijd gebruikt bij 70-80% confluentie.

De levensvatbaarheid van PC12 cellen werd bepaald met behulp van eenCell Counting Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, China). Cellen werden gezaaid in 96-well platen met een dichtheid van 1×105/well. Na 24 uur cultuur werden de cellen behandeld met NaN3 (0-80 mM) en geïncubeerd gedurende 12, 24, 48 en 72 uur om het celbeschadigingsmodel op te stellen. Vervolgens werd 10 µlCCK-8 oplossing (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) toegevoegd aan elk putje en nog eens 2 uur geïncubeerd onder de standaardomstandigheden (37°C en 5% CO2). De absorptie bij een golflengte van 450 nm werd bepaald met de ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). De celdichtheid werd berekend aan de hand van de gemiddelde optische dichtheid van 6 putjes. De experimenten werden uitgevoerd in drievoud. De geschikte concentraties NaN3 voor gebruik in volgende experimenten werden bepaald op basis van de resultaten van de celdoodbaarheidstests.

Nucleaire morfologie van DAPI-gekleurdePC12-cellen

PC12-cellen werden blootgesteld aan 0, 10, 20 en 40 mMNaN3 gedurende 24 uur. Om geprogrammeerde celdood te onderscheiden van niet-apoptotische celdood, werden de kernen gekleurd met 10 µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). In het kort werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na drie wasbeurten werden de gefixeerde cellen gekleurd met DAPI (1:5.000) gedurende 5min en vervolgens gewassen met PBS. Fluorescentiebeelden werden verkregen met een Leica DMI fluorescentiemicroscoop (vergroting, ×400).

Meting van apoptotisch tarief

Een Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (Beyotime Institute of Biotechnology) werd gebruikt om apoptose van cellen te bepalen volgens de instructies van de fabrikant.Experimenten werden herhaald in drievoud en werden uitgevoerd als volgt: De apoptose van controle PC12 cellen (0 mMNaN3) en PC12 cellen blootgesteld aan 10, 20 en 40 mMNaN3 gedurende 24 uur werd gemeten met flow cytometrie (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS statistische software v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Meting van mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm)

ΔΨm is een belangrijke parameter voor de mitochondriale werking. Dit werd beoordeeld door middel van kleuring met JC-1, een fluorescentieprobe. De experimenten werden herhaald in drievoud en werden als volgt uitgevoerd: Controle PC12 cellen werden behandeld met 0 mM NaN3; en experimentele PC12 cellen werden blootgesteld aan 10, 20 en 40 mM NaN3 gedurende 24 uur. Vervolgens werden de cellen, volgens het protocol van de fabrikant (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), geïncubeerd met het medium dat JC-1 (1X) bevatte bij 37°C gedurende 20 min, de cellen werden driemaal gewassen met wasbuffer en verzameld met vers medium zonder serum. Tegelijkertijd werd de positieve controle behandeld met carbonylcyanide-3-chloorfenylhydrazone (CCCP), een remmer, (10 µM) bij 37°C gedurende 20 minuten. Vervolgens werd de rode/groene fluorescentie bepaald met FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). De verhouding tussen de intensiteit van de rode fluorescentie en de intensiteit van de groene fluorescentie vertegenwoordigde de niveaus van ΔΨm.

Meting van de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS)

ROS in PC12-cellen werd beoordeeld met een ReactiveOxygen Species Assay-kit (S0033; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China). Intracellulaire ROS-generatie werd beoordeeld door middel van 2′,7′-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA), een fluorescerende probe. Intracellulaire ROS oxideren DCFH-DA, waardoor de fluorescerende verbinding 2′,7′-dichloorfluoresceïne (DCF) ontstaat, en de intensiteit van de DCF-fluorescentie wordt geacht parallel te lopen met de hoeveelheid gevormde ROS, volgens de instructies van de ROS-assaykit.De experimenten werden in drievoud herhaald en als volgt uitgevoerd: de positieve controle werd behandeld met een specifieke concentratie Rosup (50 mg/ml); controle PC12-cellen werden behandeld met 0 mM NaN3; en experimentele PC12-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan 10, 20 en 40 mM NaN3. Bovendien werden PC12-cellen behandeld met DCFH-DA (10 mM), opgelost in serumvrij DMEM (1:1.000) gedurende 20 min bij 37°C en vervolgens driemaal gewassen met serumvrij DMEM. De positieve controle werd behandeld met Rosup, om de ROS-productie op te wekken. De ROS-productie werd bepaald met FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) vertegenwoordigde de niveaus van ROS.

Meting van cellulair ATP-gehalte in PC12-cellen

Experimenten werden in drievoud herhaald en als volgt uitgevoerd: Controle PC12 cellen werden behandeld met 0 mMNaN3; en experimentele PC12 cellen werden blootgesteld aanNaN3 in verschillende concentraties (10, 20 en 40 mM) gedurende24 u. Vervolgens werd het cellulaire ATP gehalte bepaald met behulp van eenFirefly Luciferase ATP Assay kit (Beyotime Institute ofBiotechnology) volgens het protocol van de fabrikant.

Western blot analyse

PC12 cellen werden blootgesteld aan 0, 10, 20 en 40 mMNaN3 gedurende 24 uur, gelyseerd in radioimmunoprecipitatie assaylyse buffer (Beyotime Institute of Biotechnology) met aprotease remmer en gecentrifugeerd bij 13.362 × g gedurende 10 min bij 4 ° Com de supernatanten te verzamelen. Vervolgens werden de eiwitconcentraties bepaald met behulp van de BCA-kit (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Gelijke hoeveelheden proteïnen (90 µg) werden onderworpen aan 10 en 12% SDS-PAGE, en vervolgens overgebracht op polyvinylidenefluoride membranen (0.45 µm) met behulp van een Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Na blokkering met 5% boviene serumalbumine in TBS met 0.1% Tween-20 (TBST) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, werden de membranen geïncubeerd met primaire antilichamen tegen Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1,000), Tfam (Abcam;1:1,000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell Signaling Technology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurine A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1,000), gefosforyleerd (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1,000), p-p38 MAPK (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1,000), p-extracellulair signaal-gereguleerd kinase (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1,000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-geassocieerd X-eiwit (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc, Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) en cytochroom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) bij 4°C gedurende een nacht. De membranen werden vervolgens gewassen met TBST en geïncubeerd met aan horse-radish peroxidase (HRP) gekoppelde secundaire antilichamen (konijn; cat. nr. A0208;1:1,000; of muis; cat. no. A0216; 1;1,000; beide Beyotime Institute of Biotechnology) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De immunoreactieve banden werden gevisualiseerd met het versterkte chemiluminescentiesysteem (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) en kwantitatief geanalyseerd met Image J versie 1.32 J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA), en β-actine werd geselecteerd als laadcontrole.

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS-statistische software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). De gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie of de standaardfout van het gemiddelde. De statistische significantie van de verschillen tussen de groepen werd bepaald door een eenzijdige variantieanalyse gevolgd door Bonferroni post-hoc tests. P<0.05 werd beschouwd als aanduiding van een statistisch significant verschil. Elk experiment werd minstens drie keer herhaald.

Results

NaN3 remt de groei vanPC12 cellen

Het effect van blootstelling aan NaN3 op de proliferatie van PC12 cellen werd beoordeeld door CCK-8 assay. Cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties (0-80 mM) van NaN3 gedurende 12-72 uur. Tabel I en Fig. 1A-D geven aan dat de levensvatbaarheid van de cellen werd verminderd door NaN3 op een concentratie-afhankelijke manier. Bijna 100% van de cellen stierf na blootstelling aan 80 mM NaN3 gedurende 72 uur, wat aangeeft dat NaN3 duidelijk celdood induceerde, en de cytotoxiciteit van NaN3 werd gedetecteerd op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. Blootstelling aan NaN3 in een concentratie van 20 mM gedurende 24 uur veroorzaakte een duidelijke celdood in dePC12 -cellen (50%). Daarom werden de cellen die 24 uur gekweekt waren, gebruikt voor verdere experimenten.

Tabel I.

NaN3 onderdrukt de groei van PC12-cellen (n=6).

Celmorfologie

In DAPI-kleuring werden de morfologische veranderingen van PC12-cellen waargenomen door fluorescentiemicroscopie na blootstelling aan verschillende concentraties van NaN3. De fragmentatie van celkernen blootgesteld aan NaN3 gedurende 24 uur werd waargenomen, en het krimpen van de celkernen en de chromatinecondensatie namen licht toe met de concentratie van NaN3 in PC12-cellen in vergelijking met de controle. In deze cellen waren de apoptotische cellen kleiner en helderder in vergelijking met normale cellen. Chromatinecondensatie en fragmentatie van de kernen werden ook waargenomen, terwijl in de controlegroep blauwe kernen van levensvatbare cellen werden geïdentificeerd.Bovendien namen het aantal apoptotische cellen en de intensiteit van de groene fluorescentie toe in cellen die aan NaN3 werden blootgesteld (Fig. 2).

Apoptosebepaling door Annexine V-FITC-kleuring

Dode cellen of laat-apoptotische cellen die de integriteit van de celmembraan hebben verloren, kunnen met propidiumjodide worden gekleurd. Door het verlies van de integriteit van de celmembraan kan Annexine V-FITC in het cytoplasma terechtkomen en zich binden met de fosfatidylserine binnenin de celmembraan, waardoor de dode cellen een groene fluorescentie vertonen. Fig. 3 toont aan dat het aantal apoptotische cellen 5,03, 8,02, 43,77 en 78,67% (P<0,05) bedroeg in de PC12 cellen na blootstelling aan NaN3 bij verschillende concentraties (0, 10, 20 en 40 mM) gedurende 24 uur, respectievelijk. Deze resultaten bevestigden bovendien dat NaN3 op een dosisafhankelijke manier celapoptose induceerde.

Veranderingen in het mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm)

Mitochondriën worden algemeen beschouwd als belangrijke regulerende organismen die betrokken zijn bij de levensvatbaarheid van cellen. Daarom werd ΔΨm gebruikt als indicator van de mitochondriale functie. PC12 cellen werden gekleurd met JC-1, een kationische kleurstof die een potentiaal-afhankelijke ophoping in mitochondriën vertoont. Rode fluorescentie (J-aggregaten), die actieve mitochondriën met een stabiele membraanpotentiaal vertegenwoordigt, werd waargenomen in een klein aantal cellen blootgesteld aan toenemende concentraties van NaN3. Groene fluorescentie (J-monomeer) daarentegen, die apoptotische mitochondriën met een beschadigde ΔΨm vertegenwoordigt, werd in een aantal cellen waargenomen. De verhouding van rode en groene fluorescentie nam geleidelijk af in de controlegroep (Fig. 4).

NaN3-geïnduceerde accumulatie van mitochondriale ROS

Het is bekend dat mitochondriën de primaire bron van cellulaire ROS zijn, en ROS een belangrijke rol spelen bij de inactivatie van apoptotische signalering. Daarom werd ook de rol van ROS in NAN3-geïnduceerde PC12 celdood onderzocht. Fig. 5 geeft aan dat de fluorescentie intensiteiten in controle cellen en cellen blootgesteld aan NaN3 bij verschillende concentraties (0, 10, 20 en 40 mM) gedurende 24 uur 3.65, 6.99, 18.63 en 39 waren.35, respectievelijk, wat aangeeft dat blootstelling aan NaN3 de productie van mitochondriale ROS aanzienlijk verhoogde in vergelijking met de controlegroep (P<0,05). Deze resultaten suggereerden dat NaN3-geïnduceerdeapoptose de productie van intracellulaire ROS verbeterde.

NaN3 downreguleert themitochondriale energieproductie van cellulair ATP

Om het ATP gehalte in PC12 cellen blootgesteld aan NaN3 te evalueren, werd de relatieve luminescentie eenheid (RLU) kwantitatief bepaald met een luminometer. Fig. 6 geeft aan dat NaN3 de mitochondriale ATP-productie remde en het cellulaire ATP-niveau geleidelijk verminderde (P<0,05).

Expressieniveaus van Pgc-1α enapoptose-geassocieerde eiwitten in PC12 cellen

De Pgc-1α expressie op eiwitniveau was significant verminderd na blootstelling aan NaN3 vergeleken met de controle (P<0,05). Bovendien zijn Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 en Cox IV bekende downstream targets van Pgc-1αdynamica in verschillende celtypes (8). In de huidige studie werd vastgesteld dat blootstelling aan NaN3 de Pgc-1α-dynamiek aanzienlijk remde op een dosisafhankelijke manier (P <0,01; Fig. 7A). Bovendien verhoogde blootstelling aan NaN3 de expressieniveaus van Bax en cytochroom c, terwijl het de expressieniveaus van Bcl-2 en procaspase-3 verlaagde (P<0,05). De verhouding Bax/Bcl-2 was ook aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de controlegroep (P<0,05; Fig. 7B).

De eiwitexpressieniveaus van andere belangrijke leden, waaronder CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK en p-p38 MAPK, werden ook beoordeeld. De resultaten toonden aan dat NaN3 de expressie van CaN en de fosforylering van CaMKII en p38 MAPK verhoogde in vergelijking met de controlegroep, terwijl de expressieniveaus van totaal CaMKII en p38 MAPK niet werden gewijzigd. Bovendien waren de verhoudingen van p-CaMKII/CaMKII en p-p38/p38 MAPK in de NaN3-groep significant verhoogd in vergelijking met die in de controlegroep (P<0,01; Fig. 7C).

Discussie

Om te bepalen of NaN3 de proliferatie van PC12-cellen remde, werd het aantal behandelde cellen in de logaritmische fase vergeleken met het aantal niet-behandelde controlecellen. Celgroei werd geremd met ~75% na 24 uur blootstelling aan 20 mM NaN3. Daarom werd deze concentratie gebruikt voor verdere experimenten. Apoptose gaat gepaard met veranderingen in de cellulaire morfologie, met inbegrip van membraan blebbing, cel krimp,chromatine condensatie, nucleaire fragmentatie en DNA-fragmentatie (9). Om bovendien de nucleaire morfologie van apoptose en de apoptose snelheid te analyseren, werden de cellen gedurende 24 uur blootgesteld aan 0, 10, 20 en 40 mM NaN3.Na de behandeling werden de cellen gekleurd met DAPI en AnnexinV-FITC/PI, en de verdeling van de kernen werd geanalyseerd. De resultaten bevestigden dat blootstelling aan NaN3 op een concentratie-afhankelijke manier apoptose in PC12 cellen induceerde.

Mitochondriën zijn betrokken bij talrijke metabolische functies, waaronder het behoud van de intracellulaire pH en de productie van ROS, die celapoptose bevorderen en reguleren (10). De kenmerken van celapoptose worden voorafgegaan door mitochondriale veranderingen, waaronder een verlies van ΔΨm, een toename van de energieproductie (ATP) en een toename van de permeabiliteit van het mitochondriale membraan. Eerdere studies hebben gesuggereerd datROS schade veroorzaken aan de mitochondriale ademhalingsketen en het verlies van ΔΨm induceren, wat de factoren zijn die de neuronale disfunctie mediëren of versterken in de loop van de neurodegeneratie, wat bijgevolg leidt tot de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten (11,12).Van NaN3 is bekend dat het degeneratie en excitotoxiciteit aanjaagt door het permeabiliteitspotentiaal van het mitochondriale membraan te verhogen via lipide peroxidatie (13-15), en NaN3 oefent zijn primaire toxische werking uit door de functie van cytochroom oxidase in de mitochondriale elektrontransportketen te remmen en de ATP-productie te verhinderen (4). In de huidige studie werd FCM gebruikt om ΔΨm en ROS-productie in PC12-cellen te identificeren. Bovendien werd de ATP-synthese in mitochondriën onderzocht na blootstelling aan verschillende concentraties NaN3. De verstoring van het plasmamembraan, de toename van de mitochondriale ROS-productie en de daling van het cellulaire ATP-gehalte suggereerden dat blootstelling aan NaN3 apoptose in PC12-cellen induceerde.

Mitochondriale celdood kan geactiveerd worden door meerdere stimuli, waaronder het ontwikkelingsprogramma, DNA-schade, endoplasmatisch reticulum stress, groeifactoren en nutriëntengebrek, virale infectie en oxidatieve stress (16). Als lid van de steeds groter wordende familie van nucleaire co-regulatoren kan Pgc-1α een grote reeks genen activeren en de expressieniveaus reguleren van genen die betrokken zijn bij het energiemetabolisme in reactie op signaalroutes die mediëren bij de thermogeenvorming, gluconeogenese, spiervezeltypeverandering enmitochondriale biogenese (17).Deze co-regulatoren bestaan en functioneren in grote multi-eiwitcomplexen, waarin zij in plaats van zich aan DNA te binden, Nrf-1/2 en Tfam reguleren en hun transcriptionele potentie moduleren door de daaropvolgende biochemische interacties te bevorderen die nodig zijn voor de inductie of repressie van gentranscriptie (8). Bovendien controleert Nrf-1/2 ook indirect de expressie van mitochondriale DNA-gecodeerde genen door de nucleair gecodeerde Tfam A, B1 en B2 (respectievelijk Tfam,Tfb1m en Tfb2m) te induceren, die de regulatoren zijn van de transcriptie en replicatie van het mitochondriale genoom (18). Eerdere studies hebben aangetoond dat NaN3 een inhibitor is van het mitochondriale ademhalingsketen complex IV, dat vaak is aangetast bij primaire mitochondriale aandoeningen (19,20). In de huidige studie werd de expressie van de Pgc-1α signaalcascade, inclusief Pgc-1α familie eiwitten (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 en Tfam) en Cox IV, eerst onderzocht in PC12 cellen om na te gaan of de signaalgebeurtenissen betrokken waren bij NaN3-geïnduceerdeapoptose. De resultaten suggereerden dat NaN3-geïnduceerdeapoptose geassocieerd was met de expressieniveaus van Pgc-1α-familie-eiwitten en Cox IV in de mitochondriaal-gemedieerde signaleringsroute. Wanneer de concentraties van NaN3 werden verhoogd, werden de expressieniveaus van deze eiwitten aanzienlijk verlaagd, wat aangeeft dat ze betrokken kunnen zijn bij de activering en ontwikkeling van apoptose.

Omgekeerd kan complex IV apoptose veroorzaken in primaire corticale neuronen, die caspase3-afhankelijk is en geassocieerd is met het vrijkomen van cytochroom c (5). Het is bekend dat mitochondriën belangrijke regulatoren van celapoptose zijn. De eiwitten van de Bcl-2-familie zijn de belangrijkste initiatoren van de mitochondriale apoptose-route. Deze familie omvat de pro-apoptotische eiwitten Bax, Bcl-2 homologe antagonist/moordenaar en Bcl-2 geassocieerde agonist van celdood en de anti-apoptotische eiwitten Bcl-2 en Bcl-extra large (Bcl-xL). In gezonde cellen is Bax een inactief cytosolisch eiwit, maar het wordt tijdens apoptose naar de mitochondriën verplaatst. Het oefent zijn pro-apoptotische effecten uit door een porie te vormen in het mitochondriale buitenmembraan, waardoor cytochroom c vrijkomt in het cytoplasma, hetgeen leidt tot de activering van caspase 3 (21). De anti-apoptotische eiwitten Bcl-2en Bcl-xL onderdrukken de functie van Bax door de integriteit van demitochondriale membraan te handhaven, waardoor het vrijkomen van cytochroom cand en de activering van caspase 3 wordt voorkomen (22). In de huidige studie verhoogde NaN3 de niveaus van pro-apoptotische Bax en cytochroom c en verlaagde niveaus van anti-apoptotische Bcl-2 en procaspase-3, wat aangeeft dat NaN3mitochondriale apoptose signalering in PC12 cellen initieerde.

Daarnaast zijn de expressieniveaus van Pgc-1αco-activatoren sterk induceerbaar op transcriptioneel niveau via een verscheidenheid van upstream signaalwegen. Bijvoorbeeld, de expressie van Pgc-1α wordt geïnduceerd door inspanning en blootstelling aan koude onder controle van stresssignalering via cellulaire Ca2+ en cyclisch adenosine 5′-monofosfaat (cAMP) signalering (23). De transcriptie van Pgc-1α kan worden beïnvloed door CaMK, calcineurine, β-adrenerge receptor/cAMP en p38MAPK (24-26). Bovendien vervult p38 MAPK, behorend tot de MAPK-familie, een spilfunctie in celproliferatie, -differentiatie, -transformatie en -apoptose, aangezien de activering van apoptose Pgc-1α via directe fosforylering kan induceren (27). In de huidige studie werden de expressieniveaus van eiwitten in Ca2+ signaleringsroutes (pan-calcineurine A en p-CaMKII/CaMKII) en p38 MAPK route (p-p38MAPK/p38 MAPK en p-Erk1/2) onderzocht om de effecten van NaN3 op intracellulaire Ca2+homeostase en p38 MAPK te onderzoeken. De gegevens toonden aan dat de eiwitniveaus van pan-calcineurine A, en de p-CaMKII/CaMKII en p-p38MAPK/p38 MAPK ratio’s verhoogd waren en het p-Erk1/2 niveau verlaagd was in de NaN3-behandelde groep, wat suggereert dat NaN3 de apoptose van PC12 cellen teweegbracht op een dosis-afhankelijke manier, en dat een dergelijke activering geassocieerd was met de Ca2+ en p38 MAPK paden. Al bij al bevestigden deze experimentele resultaten dat NaN3 de apoptose van PC12 cellen kan induceren door de Ca2+ en p38 MAPK paden te activeren. Voor zover wij weten, heeft de huidige studie voor het eerst aangetoond dat NaN3 inmitochondria-gemedieerde apoptose in PC12 cellen induceert via Pgc-1α-geassocieerde signaalwegen, inclusief Ca2+/p-CaMKII en p38 MAPK.

Samenvattend heeft de huidige studie aangetoond dat NaN3 apoptose van PC12 cellen kan induceren. Om het onderliggende toxische mechanisme van blootstelling aan NaN3 op te helderen, werden de expressieniveaus van een reeks pro-apoptotische eiwitten (Bax en cytochroom c) en anti-apoptotische eiwitten (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII en Pgc-1α) onderzocht. De resultaten bevestigden dat pro-apoptotische eiwitten pro-apoptotische effecten op PC12 cellen uitoefenden via activering en fosforylering van CaMKII en p38 MAPK, die de activering van Pgc-1α en procaspase-3 in PC12 cellen stimuleerden. De gegevens vormen een basis voor latere studies die de werkingsmechanismen van NaN3 op moleculair niveau onderzoeken. Toekomstige studies kunnen de toevoeging van beschermende middelen omvatten, bijvoorbeeld mitochondriale delingsinhibitor 1, een derivaat van quinazolinone dat een nieuw-geïdentificeerdemitochondriale delingsinhibitor is, voorafgaand aan de behandeling met NaN3, om de neuroprotectieve effecten van het beschermende middel te onderzoeken in het afzwakken van NaN3-geïnduceerdeapoptose in PC12 cellen, en om bovendien het onderliggende mechanisme op te helderen.

Acknowledgements

Not applicable.

Funding

De huidige studie werd financieel ondersteund door de subsidies van de National Natural Science Foundation van China (grantno. 81571848) en de Priority Academic Program Development van Jiangsu instellingen voor hoger onderwijs.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De datasets die gebruikt of geanalyseerd zijn tijdens deze studie zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.

Bijdragen van de auteurs

YZ en SZ bedachten en ontwierpen de studie. YZ, JH,HX, TG en YW hebben de gegevens verzameld. YZ, JH en HX analyseerden en interpreteerden de gegevens, en stelden het manuscript op. Alle auteurs reviseerden het manuscript kritisch, en lazen en keurden de finale versie van het manuscript goed.

Ethische goedkeuring en toestemming tot deelname

Niet van toepassing.

Toestemming van de patiënt voor publicatie